Western Blot

 Western blot检测方法

1)              制胶：灌制10%分离胶和5%浓缩胶。待浓缩胶凝固后，小心地拔出梳子，移入电泳槽，加电泳缓冲液。

2)              上样：各组样品加上样缓冲液并经99℃变性5 min，短暂离心后上样。样品上样量约50 μg，预染蛋白Marker上样量为5 μl。

3)              电泳：将电泳槽与电源连接，起始电压80 V，待染料前缘进入分离胶后调电压至120 V。继续电泳至溴酚蓝到达分离胶底部。

4)              电转：电泳结束后，准备转膜。剪6张滤纸和1张PVDF膜，其大小、形状与凝胶一致。PVDF膜先在甲醇中浸泡激活约20 sec，然后与滤纸一起放入电转液中平衡10 min。打开凝胶夹，以黑色板为阴极，从黑色板向上依次放入海绵、3张滤纸、凝胶、PVDF膜、3张滤纸、海绵。除去气泡夹紧凝胶夹，放入转移槽中，黑色板对准阴极，安装好转移装置，加入电转液，200 mA恒定电流，转移1-2 h。

5)              封闭：电转结束后，把PVDF膜取出，浸泡在5%脱脂奶粉中，室温封闭1 h。

6)              一抗孵育：用1%BSA按zei佳比例稀释一抗，4℃孵育过夜。抗体稀释度分别为KCa1.1 (1:500)、 Homer 1a (1:500)、Homer 1b/c (1:2000)、β-Actin (1:10000)。

7)              洗涤：TBS-T洗涤3次，每次10 min。

8)             二抗孵育：用1%BSA稀释HRP标记的二抗（山羊抗鼠IgG和山羊抗兔IgG稀释度均为1:10000，驴抗羊IgG稀释度为1:5000），与PVDF膜在室温下孵育约1 h。

9)              洗涤：TBS-T洗涤3次，每次10 min。

10)          ECL法显色（暗室操作）：

l      配制ECL工作液：取等体积的A液和B液混合，放置使之升到室温。

l      将PVDF膜与工作液充分接触，室温孵育3 min。

l      曝光：暗盒中铺一张保鲜膜，将PVDF膜去尽残液，贴在保鲜膜上，然后再覆盖一层保鲜膜。黑暗中放入X光胶片，压在包好的膜上。关上暗盒，开始计时，根据信号强弱适当调整曝光时间，一般为1～5 min。

l      显影，定影：曝光完成后，打开暗盒，取出X光胶片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。将X光胶片在水中冲洗一下，去掉显影液，然后浸入定影液中，定影时间一般为5~10 min，用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。

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