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细胞凋亡实验步骤

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细胞凋亡检测试剂盒

               In Situ Cell Apoptosis Detection Kit IPOD

产品编号:MK1020

 

保存期:十二个月。-20℃冷冻保存。

 

工作原理

在机体内部随时都在发生着细胞的死亡。传统上用显微镜来观察细胞的死亡,其特征为核染色质的浓缩及碎片的形成。但是这种现象出现的很晚,时间也很短暂。凋亡的特征是内源性核酸内切酶被激活,细胞自身的染色质或DNA被切割,出现单链或双链缺口,并产生与DNA断点数目相同的3’-OH末端。末端脱氧核糖核酸转移酶(Terminal deoxynucleotidyl Transferase )可以将地高辛标记的dUTP  (DIG-dUTP)标记至3’-OH末端,DIG-dUTP结合在DNA断点部位,可以通过生物标记的抗地高辛抗体(Anti-DIG-Biotin)反应后,再结合链酶亲和素-过氧化物酶(SABC),然后加入显色底物DAB予以显示。凋亡的细包核呈黄色,从而可以在显微镜下观察到着色的凋亡细胞。

 

试剂盒内容

1.         标记缓冲液(Labeling Buffer)             1ml

2.         末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT,×20)      20μι

3.         DIG-dUTP  (×20)                     20μι

4.         封闭液(Blocking Reagent)                4ml

5.         生物素化抗地高辛抗体(× 100)         20μι

6.         SABC  (× 100)                      20μι

7.         Proteinase K (×200)                   50μι

8. 抗体稀释液                           4ml

阳性对照片2张

用户自备试剂

1.         多聚赖氨酸或APES(博士德公司有售)。

2.         0.01M TBS,PH7.5(配法:1L双蒸馏水中加入8.5克氯化钠,1.2克Tris 和0.45—0.5ml纯

    乙酸。)

3.         DAB显色试剂盒(博士德公司有售),也可自配显色剂。

 

操作步骤

1.         样品处理

(1)       玻片预先用多聚赖氨酸或APES进行处理。

(2)      细胞涂片和冰冻切片:zei重要的是及时固定。用4%多聚甲醛【用0.01M PBS(PH7.0---7.6)稀释的多聚甲醛】室温下固定30—60分钟。0.01M PBS洗2分钟×2次。蒸馏水洗涤2分钟×2次。

(3)      组织:有条件时应及时固定。常规4%多聚甲醛/0.01M PBS(PH7.0---7.6)或10%中性缓冲福尔马林固定4小时以上,石蜡包埋。切片常规脱蜡入水(脱蜡务必干净)。

2.         新鲜配制3%H2O2,室温处理10分钟。蒸馏水洗涤2分钟×3次。

3.         标本片加0.01M TBS 1:200新鲜稀释Proteinase K 37℃消化1—15分钟,0.01M TBS洗2分钟×3次。(细胞涂片和冰冻切片一般不消化或消化10—60秒钟。新鲜石蜡切片消化5-10分钟。陈旧石蜡切片消化10-15分钟)。

4.  标本片加标记缓冲液(Labeling Buffer) 20μι/片,以保持切片湿润。按每张切片取TdT

和DIG-d-UTP各1μι,加入18μι标记缓冲液中,混匀。甩去切片上多余液体后加

标记液,20μι/片。置样品于湿盒中,37℃标记2小时。

5.       0.01M TBS洗2分钟×3次。

6.        加封闭液50μι/片,室温30分钟,甩掉封闭液,不洗。

7.       抗体稀释液1:100稀释生物素化抗地高辛抗体:(取1ml抗体稀释液加生物素化抗地高辛抗体10μι),混匀后50μι/片加至标本片上。置样品于湿盒中,37℃反应30分钟。0.01M TBS洗2分钟×3次。

8.       抗体稀释液1:100稀释SABC取1ml抗体稀释液加SABC 10μι,混匀后50μι/片加至切片。37℃反应30分钟。0.01M TBS洗5分钟×4次。

9.       DAB显色:取1ml蒸馏水,分别加入DAB试剂盒中A,B,C试剂各一滴,混匀后  

    加至标本片上,显色10-30分钟左右。水洗。

10.   苏木素轻度复染。0.01M TBS洗,蒸馏水洗。脱水,透明,封片。显微镜观察。

 

结果判定

细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞,即凋亡的细胞。

 

注意事项

1.       试剂盒严格-20℃存放。

2.初用时如试管底部无可见的试剂,在离心机离心5分钟,使试剂沉至管底。

3.检测过程中切勿使样品干涸。

 

 

 

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(武汉市关山二路特1号 国际企业中心3号楼5楼)

430074   027-67845390,1,2,3,5  8008808748 

传真:027-67845396

 

 

 

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注:该产品未在中华人民共和国食品药品监督管理部门申请医疗器械注册和备案,不可用于临床诊断或治疗等相关用途

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