RSAM-03 可变剪接分析-

RSAM-03 可变剪接分析

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RSAM-03 可变剪接分析

RNA转录组变异不仅体现在表达量的变化，也会体现于转录本可变剪切异构体的结构。差异转录组调控分析的重要应用和研究领域是利用转录组RNA-Seq测序数据对比对组的可变剪切事件的差异性进行解析，可侦测获得实验设计中更多有关细胞分化，发育或与疾病表型相关的调控基因的功能。RNA-Seq测序提供了深度的转录组数据，可以用于识别比对组之间差异的可变剪切事件。本公司方案将采用不依赖于转录本(transcript)或基因注释（gene annotation）的可变剪切预测分析方法；基于可变剪切图模式(splice graph)理论，可以比传统其他可变剪切分析算法（AS）更为精准地识别出差异转录本异构体。该分析主要步骤：（1）从RNA-Seq数据内预测并构建出外显子与内含子结构序列，并识别出可变剪切模式；（2）对每份样本数据出现的每类可变剪切模式进行可变剪切异构体的表达量计算，并在样本群体中进行比较；（3）利用非参数检验方法计算组别之间存在的显著差异的可变剪切模式，并用FDR控制假阳性结果。本方法的敏感度与特异度经过众多项目的实际应用，qRT-PCR实验验证对预测识别出的差异可变剪切体可以得到较好的重现率。

AS（Alternative Splicing）分析方法

本项分析是采用splice grap算法探测RNA-Seq转录组数据中差异的可变剪接事件（Differential Alternative Splicing Events）。该方法的优点在于（1）提供严格的统计学分析流程（框架framework）分析可变剪接体。（2）从复杂的包含信号（序列）噪音的RNA-Seq数据中稳健地识别异构体/可变剪接体在样本之间的差异比值。本项目分析可以准确探测到转录组中存在的差异性转录事件。本分析不依赖于已知的转录本注释坐标信息，可以发现新可变剪切体和转录调控事件；同时计算差异转录本的表达差异性。通过识别检验转录本可变剪接体在样本内与样本之间表达变异，采用可变剪切体模式搜索技术准确识别可变剪接体（AS，Alternative Splicing）发生的位置；并采用非参数检验方法计算分析表达量的差异，目前比其他报道的可变剪切分析算法更准确灵敏。

产品优势

传统方法识别可变剪切是基于已知的注释的基因可变剪切模式而无法识别新的可变剪切模式；
本方法不依赖与基因模式，不仅可以高灵敏地识别已知注释的基因可变剪切模式，更可以探测全新可变剪切模式；
传统方法只能识别转录本中的单一一种可变剪切形式；本方法可以同时识别更复杂的含有多种可变剪切的模式（>=2种）。
本方法可以提供灵活多样的数据后期可视化展示，可以利用UCSC，IGV等基于网络云端或本地桌面系统的基因组展示系统检索展示可变剪切事件。
比传统可变剪切分析方法更灵敏准确的计算差异表达的可变剪切事件和转录本表达量，可识别出传统方法发现不到的全新（de novo）可变剪切事件。

通过本方案的分析重构的转录组转录本结构（Reconstruction），对比已知转录本的结构侦测到AS可变剪切事件类型如下

应用案例说明

举例1：AS事件识别具有高准确率和高灵敏度

具有较高复杂度水平的基因转录本结构是很难被预测识别和被定量的，并且需要高覆盖度的测序数据做支撑。不准确的转录本预测和定量问题将导致差异基因的高假阳性识别率，且会导致丢失真正意义的差异表达基因（可变剪切事件）信息。例如，利用本方案可以识别出PI4KB基因的2个可变剪切模式（红色标记区域），这2个事件却未能被其他分析方法所发现，说明该方法的准确度和灵敏度很高。分析结果说明第一个可变剪切模式在两组别之间存在显著差异，且在条件Day3组内出现相对Day35显著高表达的exon-skipping比例。本解决方案在不利用基因注释情况下仍然可以准确识别出这2种AS事件。另外，传统方法也未能准确识别差异表达的转录本外显子（转录本TCONS_00003827， 00003831 ，00003833所包含的第5个外显子）。而整体基因表达量传统分析方法也不能准确判断其真实存在的差异性，本方案可以准确识别该基因整体表达量上也存在显著差异。