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客户文章+2！且看蛋白质组学于多领域中大显身手
蛋白质是功能的执行者，其功能改变与表型息息相关，应用蛋白质组学技术可揭示复杂的生命表型变化，在农业生产，疾病机理机制研究，植物胁迫机制研究等领域具有广泛的应用。今天依旧是两篇项目文章，快跟着小编来看下蛋白质组学的应用实例吧～
多致敏表型具有独特的口腔免疫微环境 当前，过敏性疾病已经成为严重影响人体健康的全球性问题。研究发现多致敏和单致敏是过敏性疾病患者的不同表型，其中前者由于常伴有复杂的多器官症状和多病态特征，为过敏性疾病的诊断和治疗带来了挑战和困难。最新研究指出，口腔微生物群（OM）及口腔黏膜免疫的失衡与过敏性疾病的发病机制有关，但不同表型患者的口腔微环境特征是否存在差异尚未得到解析。 今年3月，浙江工商大学食品科学与生物技术学院傅玲琳教授在欧洲过敏与免疫学学会（EAACI）官方杂志Allergy上发表了最新研究成果。该研究探究了不同过敏表型患者的口腔微生态和局部免疫微环境特征。 本研究收集了30例受试者的唾液，包括11例无过敏反应的健康人群，19例临床诊断为具有特异性过敏反应的患者人群，其中9例为仅对食物或吸入性致敏原过敏的单致敏患者，10例为同时对多种食物和吸入性致敏原过敏的多致敏患者。取受试者早餐刷牙后的静息唾液（9:00~10:00 am）分别进行细胞因子测定、菌群16S测定及蛋白质组测定，从而构建不同过敏表型患者的口腔微环境-免疫图谱，为探究多致敏表型的机制提供新的见解。具体技术路线如图1所示。 图1 技术路线图 1. 多致敏患者具有独特的唾液免疫特征 生化法测定HC和AP两组受试者唾液中总蛋白、蛋白酶活以及免疫球蛋白的水平。结果表明，AP组唾液中总蛋白和蛋白酶活性显著高于HC组，两组唾液总IgE、IgG1、IgG2无显著性差异。多因子检测技术测定两组唾液中27个细胞因子，结果显示MIP-1α和FGF-basic在AP组和HC组之间具有显著差异，这两种因子可参与气道炎症和过敏性呼吸系统疾病的发生发展。对AP组进行无监督聚类分析，结果显示AP组细胞因子图谱可聚类成两个cluster，其中AP Clus2显示出相对较高水平的IL-12、IL-4、IL-9、FGF-basic和MIP-1α，但MCP-1和IL-1RA的水平低于AP Clus1。此外，AP Clus1与HC唾液相比，细胞因子没有表达差异，而AP Clus2与HC组相比，有多达10种细胞因子的表达差异具有统计学意义。值得注意的是，APClus2中的所有受试者均为多致敏表型患者，说明多致敏患者具有独特的唾液免疫特征。 2. 多致敏患者的唾液免疫因子与OM失衡有独特关系 16S rRNA-seq测定OM构成。结果表明，4组受试者(HC、AP、 APClus1、APClus2)的口腔细菌总负荷相似，而AP Clus2的Shannon指数显著高于HC， AP和AP Clus1的Shannon指数之间无差异。此外，细菌相对丰度和β-多样性分析表明，AP Clus2 vs HC的OM差异显著性高于AP Clus1 vs HC。这些结果表明多致敏患者口腔内的菌群失衡程度更高。LEfSe分析进一步表明AP Clus2的OM中可能存在某些菌群成员的损耗或富集，如与AP Clus1相比，AP Clus2中普氏菌属（Prevotella）类群减少，而普氏菌在预防人类过敏性疾病有关。最后，对唾液细胞因子与菌群进行相关性分析，结果发现奈瑟菌属（Neisseria）、普氏菌属(Prevotella)、韦永氏球菌属（Veillonella）和链球菌属（Streptococcus）的丰度与Th1-型因子 (IL-1β和TNF-α)、IL-9和嗜酸性粒细胞相关细胞因子的局部分泌显著相关。总的来说，这些数据表明微生物群-口腔黏膜免疫相互作用的变化在AP Clus2的多致敏状态中发挥了关键作用。 3. 唾液蛋白质组构建多致敏个体的口腔蛋白图谱 采用LC-MS/MS对受试者唾液进行蛋白质组测定及差异分析，共发现113个宿主蛋白（DEPHost）和55个微生物蛋白（DEPOM）在AP Clus2和HC两组中呈现显著差异表达。宿主和OM蛋白质组数据的分级聚类均表明HC和AP Clus2的蛋白表达差异，同时证明了宿主和微生物组之间的强烈相互作用。组学关联分析表明DEPHost/OM水平与OM菌群丰度之间存在一定的相关性。进一步进行聚类和KEGG分析，发现与OM 相关的DEPHost可参与哮喘、气源性过敏、肠道免疫等关键信号通路（如PI3K-Akt、NF-κB、PPAR信号通路等）；OM相关的DEPOM主要与碳水化合物和丙酸代谢有关，而口腔中包括丙酸在内的短链脂肪酸水平与食物过敏中的发生存在潜在关联。这些证据表明多致敏表型是特异性疾病的独特表型，且与其口腔免疫微环境的失衡有关。 本研究对不同过敏表型患者的口腔环境进行了多维度分析，结果显示多致敏是一种独特的临床表型，与OM的生态失调密切相关，同时亦与细胞因子局部分泌和免疫平衡紊乱有关。这些数据强调了复杂的OM-宿主口腔环境在调节多病态和多致敏中的作用，其结果一方面有利于进行多致敏表型中OM功能的机制研究，另一方面，强调了口腔可作为基于微生物组干预预防和治疗过敏性疾病的一个靶点部位。 急性缺氧和复氧对鲢肝脏和脑的损伤
1. 急性缺氧和复氧对鲢肝脏和大脑的影响
作者检测了试验组和对照组的肝脏生化指标（血清碱性磷酸酶（ALP）、谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT））活性有显著差异。与对照组相比，缺氧组及复氧组血清ALT活性均显著增加（图1A）；同样，血清AST活性和ALP活性也有类似地增加趋势（图1B、C）。在缺氧处理后，肝脏合成的主要蛋白—总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLB）水平降低， 然而，在复氧过程中，它们逐渐恢复到基础水平（图1D-F）；血清总胆固醇（TC）水平在缺氧期间显著下降，然后在复氧后增加到对照组水平（图1G）；大脑中两种主要神经递质—乙酰胆碱（ACh）和多巴胺（DA），在缺氧和复氧过程中则表现出相反的趋势（图1H-I）。
图1 缺氧-复氧处理对鲢幼鱼肝脏和大脑功能相关生化指标的影响 2. 鲢肝脏及大脑中的蛋白质的鉴定、定量和注释分析 使用TMT蛋白质组学分析，分别在肝脏和大脑中鉴定出6802和8358种蛋白质，并分别在肝脏和大脑中定量了6794种和8353种蛋白质，并通过GO、COG、KEGG、InterPro (IPR)和Cell-mPLOC对肝脏和大脑中的所有量化蛋白质进行注释。 3. 肝脏和脑对急性缺氧和复氧后反应的蛋白质组变化 经统计分析，缺氧组与对照组肝、脑DAPs分别为292个和30个；复氧组和缺氧组肝、脑DAPs分别为237个和18个；复氧组与对照组肝、脑DAPs分别为798个和56个 (图2A、D)。维恩图显示肝脏和大脑中各组共有差异蛋白（图2C、E）。PCA分析显示，对照组、缺氧组和复氧组的肝脏中的蛋白质明显分离 (图2B)。聚类热图显示了大脑中90个DAPs的相对表达，揭示了对照组、缺氧组和复氧组之间存在显著差异（图2F）。 图2 对照组、缺氧组和复氧组鲢幼鱼肝、脑差异蛋白表达分析 4. 肝脏中DAPs的生物信息学分析 通过模糊聚类分析，将缺氧组与对照组、复氧组与缺氧组、复氧组与对照组共890个DAPs划分为8个集群(图3A)。GO分析将每个集群中的DAPs分为不同的功能类别（图3），其中Cluster2中免疫反应相关terms显著富集，Cluster3中铁稳态相关terms显著富集，Cluster8中氧化还原过程显著富集。此外，在大多集群中，代谢过程显著富集，包括核苷代谢，氨基酸代谢，碳水化合物代谢和肌醇代谢功能。 图3 缺氧-复氧处理的鲢幼鱼肝脏中890 DAPs的共表达模块 通过将各组中的DAPs进行KEGG通路分析（图4），发现参与细胞群落、运动、增殖和存活的途径有3条，包括ECM-受体相互作用、局灶性黏附和肌动蛋白细胞骨架的调节；而2种途径参与铁稳态，包括矿物质吸收和铁死亡。参与免疫反应的补体和凝血级联反应、金黄色葡萄球菌感染和上皮细胞的细菌入侵也相对富集。此外，代谢相关过程、糖酵解/糖异生、半乳糖代谢、果糖和甘露糖代谢也得到了富集。 值得注意的是，缺氧组和对照组之间有6个DAPs，即血清转铁蛋白1 (TF1)、血红素加氧酶1 (Hmox-1/HO-1)、核受体共激活因子4 (NCOA4)、锌转运蛋白ZIP8 (SLC39A8/ZIP8)、铁蛋白和中/重亚基（FerM 和 FerH），在铁死亡信号通路中富集；而在复氧组和缺氧组之间有5个DAPs，即HO-1、FerH、ZIP8等，同样在铁死亡信号通路中富集。有趣的是，HO-1和ZIP8在缺氧期间上调，而在复氧期间下调；FerH在缺氧期间下调，但在复氧期间上调（图4C、D）。通过构建PPI 网络以评估差异蛋白质与上述铁死亡相关蛋白相互作用（图4B）。结果表明，在缺氧和复氧过程中，32种蛋白质参与了68种相互作用，表明了铁死亡复杂的反应过程。 图4 KEGG通路分析显示缺氧复氧后鲢幼苗肝脏铁死亡 5. 脑内DAPs的生物信息学分析 将在大脑缺氧和复氧处理中的DAPs进行GO功能分类（图5A），在缺氧组与对照组中，最具代表性的是磷脂分解过程和磷脂酶活性，其次是糖脂转运体和糖脂结合。谷氨酰胺代谢过程、神经递质:钠转运体活性、水解酶活性也明显增强。在复氧组与缺氧组中，DAPs主要富集在四吡啶结合、钴胺结合和钴胺转运方面，其次是半胱氨酸型内肽酶抑制剂活性和突触。在对比复氧组和对照组时，DAPs主要涉及神经递质转运、细胞铁离子稳态、铁离子结合等过程。 图5 脑内DAPs的生物信息学分析 对脑中的DAPs进行KEGG富集分析（图5B）, 结果表明：在缺氧胁迫下造血细胞谱系、肾素-血管紧张素系统、类固醇激素生物合成、酪氨酸代谢、类固醇合成、抗叶酸抗性和叶酸合成相对富集；在复氧条件下，矿物吸收得到富集。对DAPs进行IPR富集分析，结果显示，在缺氧组和对照组之间、复氧组和缺氧组之间，分别识别出19个和10个显著富集的功能域(图5C)，随后对DAPs进行了亚细胞定位分析(图5D)。缺氧组和对照组间胞质蛋白和核蛋白的含量显著增加，而细胞外蛋白、突触蛋白和高尔基体蛋白在复氧过程中增加。 根据功能富集分析的结果，作者选择了18个DAPs，并研究了其丰度的变化（图6）。对这些变化的研究可能有助于理解大脑对缺氧和复氧的反应，随后作者通过qRT–PCR分析验证了蛋白质组学数据的可靠性。 图6 脑内18个DAPs丰度的变化 本研究中，血清肝脏生化活性指标在缺氧条件下显著升高，氧供应恢复后继续升高，说明缺氧可能会损害鲢的正常肝功能，复氧后肝功能变差。急性缺氧和短时间复氧后，脑内主要神经递质含量发生明显变化，说明缺氧-复氧条件可能对鲢的神经系统造成损伤。肝和脑的蛋白质组学分析表明，缺氧-复氧对鲢的生长、运动、免疫和繁殖均有不良影响，并可能损害肝和脑的功能，这可能是由铁死亡、氧化应激、肝脏细胞骨架破坏和大脑神经退行性疾病易感基因的异常表达造成的。本研究结果部分解释了对缺氧敏感的鱼类大脑和肝脏缺氧和复氧损伤的机制，为耐缺氧鱼类的培育提供了参考。 [1]. Wang Y, Zhang Q, Wang C, et al. Variations in oral microbiota and salivary proteomics reveal distinct patterns in polysensitized individuals[J]. Allergy, 2022. [2]. Li X, Feng C, Sha H, et al. Tandem Mass Tagging-Based Quantitative Proteomics Analysis Reveals Damage to the Liver and Brain of Hypophthalmichthys molitrix Exposed to Acute Hypoxia and Reoxygenation. Antioxidants (Basel)[J]. 2022,11(3):589. 
| 标签： | 蛋白质组学；口腔；免疫；过敏反应 |