10x单细胞转录组测序助力解析宫颈癌不同阶段免疫微环境

前言
 

宫颈鳞状上皮就是指覆盖在宫颈表面的上皮组织，在正常情况下呈粉红色，而且复层鳞状上皮，抵抗力非常好，所以宫颈不容易招致细菌的感染。但是鳞状上皮也会发生病变，尤其是感染了高危HPV之后，宫颈的鳞状上皮就会发生病变，甚至发展成宫颈癌。

宫颈癌是人乳头瘤病毒HPV持续感染条件下，由宫颈鳞状上皮内的病变逐渐发展而来的,所以它的病变过程就是从宫颈的低级别鳞状上皮内病变,逐渐变化为宫颈的高级别鳞状上皮内病变,进一步就会变成了癌变。近年来，靶向TME策略为癌症治疗提供了一种新的治疗选择；然而，由于宫颈癌的免疫微环境在很大程度上是未知，这些方案还未被广泛应用于宫颈癌患者。

2022年6月24日，上海市复旦大学附属妇产科医院华克勤教授团队，第一作者李春波于Frontiers in Immunology（IF 8.786）, DOI: 10.3389/fimmu.2022.897366在线发表了宫颈癌单细胞测序的新研究成果。

作者对3例正常宫颈，2例高阶段的上皮内病变（High-stage intraepithelial neoplasia，HSIL），4例宫颈肿瘤和1例转移性淋巴结的新鲜组织样本进行10× Genomics高通量单细胞转录组测序，绘制了宫颈癌不同阶段免疫微环境和转录调控网络，不同的免疫微环境意味着不同的免疫治疗策略。这项研究加深了人们对宫颈癌进展过程中肿瘤免疫微环境（tumor microenvironment，TME）动态变化的理解，并对开发抑制不同发展阶段宫颈癌治疗方法具有重要意义。

期刊：Frontiers in Immunology

影响因子：8.786

发表年月：2022年6月

材料：3例正常宫颈，2例HSIL，4例肿瘤和1例淋巴转移灶的新鲜组织样本

方法：10x Genomics高通量单细胞转录组测序（由欧易生物提供技术支持）

研究背景
 

本研究首次通过scRNA-seq分析了免疫细胞和基质细胞在宫颈癌进展过程中转录状态的变化，包括正常组织、HSIL、肿瘤和淋巴结转移灶。本研究将有助于更深入地了解宫颈癌进展过程中TME的细胞特征，并有助于开发抑制宫颈癌的起始和进展的新治疗方法。
 

研究结果

Result1 单细胞测序揭示了宫颈癌进展过程中独特的免疫景观

为了揭示宫颈癌进展过程中免疫微环境的变化特征，作者对3例正常宫颈，2例HSIL，4例宫颈肿瘤和1例转移性淋巴结的新鲜组织样本进行10× Genomics单细胞测序。

经过初步质量控制，最终保留59913个细胞，其中有30968个细胞来自正常宫颈，有10944个细胞来自正HSIL，有11660个细胞来自正宫颈，剩余6341个细胞来淋巴结转移灶。随后利用t-SNE降维聚类，根据细胞基因表达值将其化为9个不同的簇（T/NK细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞、B细胞、内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞）。

作者将细胞类型的标记基因表达情况用t-SNE图谱来展示出来。

接下来对这9种类型的细胞在正常宫颈、HSIL、宫颈肿瘤、淋巴结转移灶中细胞数目和比例做出统计，发现不同患者、不同病灶见细胞分布差异很大。可以发现正常组织中，大多数细胞类型是成纤维细胞（49.4%），内皮细胞（23.8%）和平滑肌细胞（20.3%），而免疫细胞（T / NK细胞、巨噬细胞、B细胞、浆细胞和肥大细胞）的数量为5.2%，几乎不存在中性粒细胞。

在HSIL组织中，大多数细胞类型是免疫细胞，其中T / NK细胞（49.4%），巨噬细胞（17.6%），嗜中性粒细胞（13.5%），而间充质细胞（成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞）的数量相对较少。这些结果表明，宫颈癌进展的早期阶段存在明显的免疫浸润。在肿瘤组织中，T/NK细胞（39.4%）、内皮细胞（14.9%）和成纤维细胞（15.6%）最多。在转移性淋巴结中T / NK细胞（61.6%）和巨噬细胞（25.8%）的比例较高，其他类型细胞的比例较低。

Result2 不同病变中NK/T细胞的单细胞表达谱的特征分析

由于我们知道NK/T细胞在肿瘤免疫中往往起到一个核心作用，于是作者重点关注了这一类细胞的特征。根据基因表达谱，鉴定出12种T细胞。

随后对T细胞在（上皮内病变 、淋巴转移灶 、正常宫颈、原位肿瘤 ）中的功能进行GO和KEGG富集分析，以及对一些作者重点关注的功能在四个样本中进行评分。上皮内病变中显著富集富集的T细胞受体信号通路，白细胞跨内皮迁移，B/NK/T细胞活化相关信号通路。肿瘤组织中，与“抗原加工递呈”、“NK细胞药物作用的细胞毒性”、“NK细胞活化”相关的过程呈现高度富集。淋巴转移灶的功能主要与“树突状细胞趋化性富集”、“肥大细胞激活”以及“趋化性的正向调节”的过程有关。

随后结合每组样本中T细胞的数目和比例，作者发现上皮内病变中cluster 2、3、12簇高富集，提示适应性或先天免疫激活程度低，这可能与持续HPV感染和异常细胞浸润有关。肿瘤组织表现出cluster 4、5、9簇的高浸润，这与免疫抑制状态有关。

然而，转移性淋巴结中富含幼稚的和效应记忆细胞，这代表了免疫激活的早期阶段。并且作者还发现，上皮内病变中免疫相关基因的高表达利于预后，而与肿瘤组织预后较差相关。

Result3 HSIL、肿瘤和转移性淋巴结组织中NK/T细胞的不同免疫状态

由于免疫细胞类型表现出不同的组织偏好，作者重点关注CD8+ T细胞的免疫状态和细胞动态转变，并对每组样本中CD8+ T细胞的数目和比例进行统计。通过小提琴图展示了C2-tissue resident memory CD8 T cells，C4-exhausted CD8 T cells，C5-effector memory CD8 T cells，C8-cytotoxic CD8 T cells每个细胞簇中具有代表性标记基因表达情况。

接着作者对C2、C4、C5、C8这几个cluster的功能进行GO和KEGG富集分析，随后对一些重点关注的功能在C2、C4、C5、C8中进行评分，这些研究结果首次证明了HSIL是一种低激活的免疫状态（先天免疫），其特征是存在丰富的组织驻留记忆CD8+T细胞的浸润。肿瘤组织则表现为免疫抑制状态，其特征是存在耗竭型CD8+T细胞浸润。淋巴转移灶的免疫反应激活程度较低，以效应记忆CD8+T细胞和细胞毒性CD8+T细胞为特征，提示免疫反应处于早期激活阶段。

作者使用Monocle2对CD8+ T细胞进行拟时间轨迹分析，模拟出CD8+ T细胞的状态转变过程。C2细胞处于运动轨迹的起点，分别分化为C4细胞（Fate1）与C5/C8细胞（Fate2）的两个方向。Fate1分化为C4细胞，而C4代表了一个耗竭的细胞簇，作者发现肿瘤中约占43.1%的CD8+ T细胞位于Fate1分支，这意味着肿瘤中大部分CD8+ T细胞正经历了一个耗竭过程。Fate2分化为C5/C8细胞，这些细胞可以通过分泌各种细胞因子来调节其他免疫细胞的功能，淋巴结中大部分CD8+ T细胞位于Fate2分支。

Result4 不同病变样本间的髓系细胞的特征

通过对所有的髓系细胞进行了无监督聚类分析，根据基因表达谱，作者得到7种巨噬细胞和3种树突细胞，通过小提琴图和热图展示了每个细胞簇中具有代表性标记基因表达情况。

作者对7种巨噬细胞和3种树突细胞的功能进行GO和KEGG富集分析。

然而，通过计算M1和M2型巨噬细胞得分以及抗炎、免疫监视和免疫逃避得分，可以观察到主导M2型巨噬细胞得分（促癌）在肿瘤组织，和M1型巨噬细胞得分在上皮内病变（抑癌）。

值得注意的是，上皮内病变中的巨噬细胞比肿瘤中表现出更高的抗炎和促炎评分，这表明了TME的复杂性。肿瘤组织表现出免疫监视和逃逸评分，这进一步解释了免疫治疗的不良反应。

Result5 HSIL组织与肿瘤组织中巨噬细胞类型差异

由于C1-Ma-C1QA和C2-Ma-THBS1巨噬细胞分别是肿瘤/淋巴结和上皮内病变中主要富集的细胞类型。火山图显示了两种巨噬细胞之间显著差异的基因。热图展示了C1-Ma-C1QA和C2-Ma-THBS1巨噬细胞中具有代表性标记基因表达情况。

接下来对C1-Ma-C1QA和C2-Ma-THBS1巨噬细胞分别进行GO和KEGG富集分析。

对每组样本中C1-Ma-C1QA和C2-Ma-THBS1巨噬细胞的数目和比例进行统计，发现C1-Ma-C1QA巨噬细胞是肿瘤和淋巴转移灶中的主要细胞类型，而C2-Ma-THBS1巨噬细胞是HSIL中的主要细胞类型。与此同时C1QA高表达有利于预后，但THBS1高表达与预后不良相关。

利用Monocle2，作者对C1-Ma-C1QA和C2-Ma-THBS1两种类型的巨噬细胞进行拟时间轨迹分析。可以观察到C2-Ma-THBS1和C1-Ma-C1QA轨迹形成了一个连续体，但具有不同的表达特征。之前的分析表明C2-Ma-THBS1的上调基因主要在病毒转录、IL-1信号通路、NK-kB信号通路和细胞因子介导的信号通路中富集，这些信号通路的激活意味着肿瘤的进展。

C1-Ma-C1QA表现为中性粒细胞活化、T细胞活化、抗原加工和呈递等信号通路的高度富集。这些结果推断，当病变从HSIL发展为侵袭性肿瘤时，TME经历了C2-Ma-THBS1到C1-Ma-C1QA的转变。

Result6 不同病变样本间的B细胞的特征

通过对所有的B细胞进行了无监督聚类分析，根据基因表达谱，作者得到6种B细胞。通过小提琴图和热图展示了每个细胞簇中具有代表性标记基因表达情况。基于特定的细胞标记物，作者将Cluster 1定义为滤泡B细胞，将Cluster2-5定义为浆细胞，将Cluster6定义为前B细胞。

作者对6种B细胞的功能进行GO和KEGG富集分析。

利用Monocle2，作者对6种B细胞进行拟时间轨迹分析，可以观察到滤泡B细胞向浆细胞转化的趋势。

Result7 HSIL、肿瘤和淋巴结中复杂的细胞间通信网络

为了更加系统地阐明细胞间复杂的相互作用，作者绘制了细胞间配体-受体通信网络，以更好地理解HSIL、肿瘤和转移淋巴结中相邻细胞间的相互作用。

结果显示，HSIL和淋巴结中的MHC分子、MIF-CD74/CXCR4和MIF-CD74/CD44均高于肿瘤组织。而肿瘤组织则表现出更高水平的免疫检查点相关配体受体，如LGALS9-HAVCR2、LAGALS9-CD44、ICOSL-ICOS、ICOSL-CTLA4和ICOSL-CD28，这些结果进一步证实了肿瘤组织中免疫抑制TME的存在。

文章总结

这项研究分析了正常宫颈、癌前病变(HSIL)、原发性宫颈肿瘤和转移性淋巴结的单细胞图谱。首次证明了HSIL是一种低激活的免疫状态（先天免疫），其特征是存在丰富的组织驻留记忆CD8+T细胞的浸润。肿瘤组织则表现为免疫抑制状态，其特征是存在耗竭型CD8+T细胞浸润。淋巴转移灶的免疫反应激活程度较低，以效应记忆CD8+T细胞和细胞毒性CD8+T细胞为特征，提示免疫反应处于早期激活阶段。文章阐明了从癌前病变到侵袭性肿瘤再到淋巴转移灶，这个过程中TME的变化特征。这些发现为深入了解宫颈癌的特征，以及未来开发潜在的治疗方法提供了深入的见解。

欧易生物提供了该项目的单细胞转录组测序实验和分析工作。

特别致谢：感谢欧易生物巴永兵和子清珍在分析中提供的帮助。