头颈肿瘤化疗耐药的全新机制——上海交通大学医学院第九人民医院

前言

头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是一种常见的癌症，其发病率及死亡率高，预后差。基于顺铂的化疗方案是目前治疗局部晚期/转移性HNSCC重要的辅助治疗方法之一，这对提高患者的生存率至关重要。然而，固有的和获得性的顺铂耐药可直接导致患者治疗失败、复发甚至死亡。因此，对顺铂耐药机制的深入研究，探索逆转耐药和提高临床疗效的潜在靶点具有重要的临床意义。

7 月 1 日，上海交通大学医学院附属第九人民医院张建军研究员和马海龙博士作为共同通讯作者， 在BMC Medicine（IF: 11.150）杂志发表了题为的研究论文，研究首次阐明了调控HNSCC产生顺铂耐药的关键信号通路：CREB5-OP1MT-线粒体，这为开发克服顺铂耐药的潜在靶点和有效策略提供了全新的依据。

研究内容

本研究目的是探讨CREB5是否参与顺铂耐药及其潜在的分子机制。在本研究中，研究者发现CREB5通过转录激活OP1MT来调节线粒体凋亡，从而参与HNSCC顺铂耐药。新发现的CREB5/OP1MT信号轴为HNSCC的顺铂耐药提供了一个新的靶点，对克服耐药和提高临床疗效具有重要意义。

研究路线

研究结果

1、CREB5在顺铂耐药的HNSCC（CR-HNSCC）细胞中高表达，并促进顺铂耐药

首先，研究者使用表达谱芯片检测顺铂耐药CR-HNSCC细胞中的差异基因，在两种顺铂耐药细胞中均有241 个基因表达上调，交集基因显著富集于PI3K-AKT信号通路（图 1A-C）。值得注意的是，在PI3K-AKT信号通路中，CR-HNSCC细胞中CREB5的表达差异最大，且在细胞中以顺铂浓度依赖的方式高表达（图 1F-I）。同时，顺铂治疗可呈剂量和时间依赖的显著诱导AKT在Ser473位点的磷酸化（图 1D-E），磷酸化的AKT表达上调，CREB5的核易位增加（图 1J）。以上数据表明，转录因子CREB5受AKT磷酸化调控，然后易位到细胞核中。

为了进一步研究CREB5表达与HNSCC顺铂耐药之间的相关性，qPCR检测验证CR-HNSCC样本中CREB5表达上调（图 1K）。COX回归分析显示，CREB5的高表达显著降低HNSCC患者的总生存率（图 1L）。体外细胞实验表明过表达CREB5显著提高细胞中顺铂半抑制浓度，体内模型验证过表达CREB5可促进肿瘤生长，导致肿瘤重量增加（图 1M-S）。综上结果，表明CREB5可促进HNSCC的顺铂耐药。

图1 | CREB5在顺铂耐药的HNSCC细胞中表达上调，并促进顺铂耐药

2、CREB5促进HNSCC增殖，抑制线粒体凋亡

研究者接下来评估了CREB5是否影响细胞增殖、集落形成和细胞凋亡。首先，发现CREB5可以增强HNSCC细胞的增殖和集落形成能力（图 2A-D）。其次，通过流式细胞术进行细胞凋亡检测，发现顺铂诱导CREB5过表达组的HNSCC细胞凋亡率显著降低（图 2E-F）。最后为了探讨其作用机制，检测了线粒体凋亡相关蛋白的表达，发现过表达CREB5可以促进Bcl-2和Bcl-xL的表达，抑制Bax的表达和细胞色素c的释放，从而抑制细胞凋亡的线粒体通路（图 2G-H）。因此，过表达CREB5促进HNSCC肿瘤进展，抑制HNSCC线粒体凋亡。

图2 | CREB5调控亲本和顺铂耐药细胞的线粒体凋亡

3、CREB5促进靶基因OP1MT的转录

为了探究CREB5的下游基因，通过qPCR发现过表达CREB5后，HNSCC细胞中OP1MT持续上调，WB实验也验证这一结果（图 3A-D）。同时在顺铂耐药的HNSCC样本中，CREB5和OP1MT的表达呈正相关（图 3E）。此外，过表达OP1MT促进抗凋亡蛋白的表达，抑制促凋亡蛋白的表达（图 3F-G）。这些结果表明，OP1MT在调节线粒体凋亡通路的激活中具有重要作用。

随后作者推测CREB5可能促进OP1MT的转录，ChIP-PCR结果显示，基于CREB5在OP1MT启动子区域的转录因子结合基序设计的引物，能在CR-HNSCC细胞中扩增OP1MT启动子片段（图 3H）。通过双荧光素酶检测显示，在CR-HNSCC中，缺失-253bp至-257bp可降低OP1MT启动子活性（图 3I-K）。综上所述，参与线粒体凋亡的OP1MT是顺铂耐药细胞中CREB5的一个新的转录靶点。

图3 | CREB5促进HNSCC中OP1MT的转录

4、CREB5通过HNSCC中的OP1MT调节线粒体活性

为了探讨OP1MT在CREB5调节线粒体活性中的作用，作者发现过表达CREB5和OP1MT均可促进细胞氧化磷酸化的发生过程，同时，基础呼吸、ATP产生、最大呼吸和呼吸容量均增加（图 4A-D）。沉默CREB5抑制了线粒体活性，而过表达OP1MT在顺铂耐药细胞中逆转了这一结果（图 4E-J）。

这些结果表明，CREB5和OP1MT均增强了线粒体活性。过表达CREB5通过增加Bcl-2 和Bcl-xL，降低Bax、细胞色素c、裂解半胱天冬酶和PARP来抑制线粒体凋亡，OP1MT敲除逆转这一结果（图 4K-L）。这些结果证明，在顺铂耐药细胞中，CREB5通过OP1MT调控线粒体凋亡。

图4 | CREB5通过OP1MT调节线粒体活性

5、CREB5通过HNSCC中的OP1MT对顺铂产生耐药性

根据以上发现，CREB5通过OP1MT调控线粒体凋亡，作者推测CREB5可能通过HNSCC中OP1MT对顺铂产生耐药。流式细胞术和半抑制浓度检测（IC50）显示，过表达CREB5降低了凋亡细胞百分比，提高了顺铂IC50，而沉默OP1MT增加了细胞凋亡，降低了顺铂IC50（图 5A-D）。在耐药细胞系中也有相似结果（图 5E-H）。上述结果表明，CREB5通过OP1MT调控凋亡介导HNSCC对顺铂耐药。

图5 | CREB5通过OP1MT抑制HNSCC细胞的凋亡，促进对顺铂的耐药性

6、CREB5和OP1MT的双靶向克服了顺铂耐药

为了确定CREB5和OP1MT的双靶向沉默是否克服了HNSCC的顺铂耐药，作者建立了耐药异种移植小鼠模型，结果显示双靶向沉默组（siCREB5&siOP1MT）对肿瘤重量和肿瘤生长速率的抑制作用最为明显（图 6A-B）。此外，OP1MT和CREB5的双靶向沉默可显著降低Ki67的阳性率（图 6C）。

采用RT-PCR和免疫印迹法检测肿瘤组织，发现OP1MT和CREB5的mRNA和蛋白水平明显受到抑制（图 6D-E）。为了评估siCREB5和siOP1MT在HNSCC体内的治疗价值，构建了含有顺铂耐药患者样本的异种移植模型，结果显示siCREB5和siOP1MT在体内显著抑制了肿瘤的生长（图 6F-J）。这些结果表明，CREB5和OP1MT的双靶向作用对克服HNSCC的顺铂耐药有显著作用。

图6 | CREB5和OP1MT双靶向对顺铂耐药HNSCC有强大的抗肿瘤作用

7、CREB5与HNSCC患者中OP1MT的表达呈正相关

为了进一步探讨CREB5和OP1MT的相关性，免疫组化检测发现肿瘤组织中的CREB5和OP1MT均显著高于正常对照组，且CREB5的表达与OP1MT呈正相关（图 7A-D）。分析蛋白表达与临床特征的相关性，也发现CREB5和OP1MT高表达与肿瘤淋巴结转移（TNM）晚期相关（图 7E-H）。

图7 | 在HNSCC组织中CREB5与OP1MT的表达呈正相关

研究结论

本研究表明，铂类药物通过诱导AKT磷酸化，促进CAMP反应元件结合蛋白5（CREB5）发生核易位，并转录激活线粒体DNA拓扑异构酶OP1MT，随后通过上调Bcl-2和下调Bax蛋白的水平抑制线粒体凋亡，最终导致HNSCC发生化疗耐药。研究结果揭示了一种HNSCC发生化疗耐药的全新机制：CREB5-OP1MT-线粒体调控轴，这为开发与制定克服顺铂耐药的潜在靶点和有效策略提供了新的基础。

上海交通大学医学院附属第九人民医院21级硕士童桐和秦星博士为论文的共同第一作者，欧易生物在本项目中承担了表达谱芯片检测及分析工作。文中特别致谢欧易生物总监祖启东，为该项目提供数据分析服务。