单细胞测序助力揭示Myf5衍生细胞的异质性以及其缺失SRSF2后肌源性命运的改变

前言

近日，欧易生物合作客户中国科学院上海营养与健康研究所冯英研究组合作在Advanced Science（IF 16.806）发表通过单细胞转录组测序揭示Myf5衍生细胞的异质性以及其缺失SRSF2后肌源性命运改变的相关结果，郭若晨博士为文章第一作者，上海营养与健康研究所冯英研究员，济宁医学院出生缺陷研究与转化协同创新中心陈瑞蛟研究员为该论文的共同通讯作者。欧易生物提供了该项目的单细胞转录组测序和分析，文章特别致谢了欧易生物巴永兵和李炼在单细胞分析中提供的帮助。

下面我们一起学习这篇文章的具体内容。

材料：对照和SRSF2敲除小鼠胚胎分选Myf5+细胞

期刊：Advanced Science

发表时间：2022年4月23日

方法：欧易生物10× Genomics单细胞转录组测序

研究背景

肌肉祖细胞是通过形成表达一种或几种肌源调节因子 (MRF) 的成肌细胞来决定其肌源命运。肌生成过程包括成肌细胞分化为单核肌细胞，然后融合形成多核肌纤维。MRFs由 Myf5、MyoD、Myog和Myf6 组成，它们在Pax3和Pax7的下游起作用，基因靶向研究表明，MyoD 和 Myf5 均是肌源性决定基因。前期研究表明剪接因子 SRSF2 是细胞存活的关键调节因子，然而SRSF2 是否参与成肌细胞增殖和肌生成仍不清楚。因此作者结合条件性敲除和谱系追踪方法表明，缺乏SRSF2的Myf5-cre小鼠在出生时立即死亡，并且造成成肌细胞高水平凋亡，完全没有成熟的肌纤维生成。突变的Myf5衍生细胞（tdtomato 阳性细胞）随机分散在肌源性和非肌源性区域，表明骨骼肌分化所需的群落效应丧失。

单细胞 RNA 测序进一步表明 myf5 衍生细胞的高度异质性以及非肌原性细胞在没有 SRSF2 的情况下以骨骼肌细胞为代价显著增加，反映了细胞命运的改变，此外，差异基因表达分析表明，分化标志物 Myog 和 p21上调，并且 Pax7和Myf5在突变体与对照的分化拟时间期间的异常表达。

最后，SRSF2的敲低导致成肌细胞的早熟分化并导致祖细胞的耗尽。总之，这些结果表明SRSF2 是 Myf5 衍生细胞正确响应位置线索并决定其肌源性命运的重要调节因子。在成肌细胞中敲降SRSF2造成高水平的凋亡和分化缺陷。

研究内容解析

SRSF2对成肌细胞的增殖和分化的功能分析

为了探讨SRSF2在成肌分化中的作用，作者从以下几个方面进行了体内外实验验证：

（1）首先从E16.5野生型小鼠中分离出原代成肌细胞并对Pax7、Myf5、MyoD和SRSF2进行免疫荧光染色，发现SRSF2在大多数Pax7阳性和Myf5阳性成肌细胞以及约80% MyoD阳性细胞中表达。体外诱导成肌细胞分化后进行RT-qPCR分析表SRSF2在分化后mRNA水平急剧下降，与Myf5和MyoD的表达模式高度相似。分化后的C2C12细胞中SRSF2的蛋白质水平同样降低，表达分化标志物Myog的细胞也显示出SRSF2的微弱信号。转染C2C12细胞和成肌细胞SRSF2特异的siRNAs后诱导分化，对Myog和肌球蛋白重链 (MHC) 进行免疫染色显示，SRSF2的敲低显著损害了C2C12细胞和成肌细胞的成肌分化。与对照 siRNA 相比，siSRSF2 显著降低了增殖标志物 Ki67 的强度并增加了 p21 信号，蛋白质印迹 (WB) 分析进一步证明SRSF2敲低导致MyoD依赖性基因的激活，E2F1本身和E2F1依赖的细胞周期基因如Ccnb1被关闭，磷酸化pRb (p-pRb)水平下降。这些结果表明SRSF2在体外调节成肌细胞的增殖和分化中起关键作用。

（2）为了进一步探究SRSF2在成肌中的作用，作者构建了Srsf2基因表达缺陷SRSF2f/f/Myf5-Cre小鼠（MKO）。MKO新出生小鼠很快死亡，在胚胎第19天骨骼肌的组织学检查发现存在严重的分化缺陷，后肢肌肉质量显著减少，完全没有成熟纤维，后肢和肋间有高水平的细胞凋亡。E15前肢切片免疫染色显示， Pax7和Myf5表达的成肌前体细胞/成肌细胞在MKO胚胎中显著减少，并且存在大量凋亡细胞。这些结果表明Srsf2基因突变的肌肉细胞在胚胎肌发生过程中经历了异常的细胞凋亡。

（3）为了追踪Myf5衍生细胞的肌源性命运，作者构建了杂交鼠(Het:SRSF2f/W/Myf5-cre)，其可以通过tdTomato (tdT)专门标记 Myf5 表达的细胞。分别在E12.5、E13.5和E14.5制备对照和MKO/tdT小鼠的四肢横切面，tdT染色显示大部分tdT+细胞（Myf5衍生细胞）位于预期的肌肉区域，排列成同质的连贯组，与相邻的非肌肉细胞有明显的界限，这被称为肌肉发育过程中的群落效应，会激活细胞群中的肌肉基因表达，然而，这种效应在E13.5和E14.5突变小鼠中完全被破坏。对照小鼠中的Myf5衍生细胞显示出正常的肌原性，分化为功能性肌纤维，相反，MKO小鼠中的大多数tdT+细胞无法通过正常的发育程序获得肌源性命运。

（4）接下来，作者通过对Ki67进行免疫荧光染色来分析tdT+细胞的增殖率。在E14.5小鼠中，发现到对照组中Ki67/tdT双阳性细胞的数量与突变体相比减少了5倍，同时在突变小鼠中检测到大量tdT+凋亡细胞，但在对照小鼠中仅存在少数凋亡细胞。更重要的是，在E13.5和E14.5突变小鼠中观察到Pax7+细胞大量减少，这与MHC阳性纤维显著减少同时发生。随着年龄的增长，在 E14.5肢体中检测到的双阳性细胞逐渐减少。显然这些结果表明MPC经历了加速耗尽，可能是由于tdT+细胞的分散分布和凋亡增加导致。

图1 | SRSF2对体外成肌细胞的增殖和分化至关重要

scRNA-seq揭示tdT+细胞的不同亚群并确定了突变小鼠中耗竭的骨骼肌细胞群

为了表征SRSF2突变前后的Myf5衍生细胞在骨骼肌发育中的细胞命运和动力学，作者从E14 Het/tdT和MKO/tdT胚胎中分离出单核细胞，并通过流式细胞仪分选tdT+细胞进行scRNA-seq（图 2A），流式的结果也表明突变组tdT+细胞比例的显著降低（7.43% vs28.6%）。测序结果质控后，总共9439个对照组细胞和18226个MKO组细胞进行下游分析。

降维聚类后t-SNE显示共不同转录模式的19个细胞分群，基于细胞已知的细胞类型特异marker和细胞群相关性分析，作者将19个分群鉴定为共10种不同的细胞类型（图 2B）。Cluster 4 (C4) 和 C8 表达骨骼肌细胞marker，例如 Pax7、Myf5、Myod1、Myog和Myh3,其余9种细胞类型为非肌源细胞，分别为由C1、C3、C5 和C11组成的间充质细胞（Mesen）高表达Pdgfra和Dcn；软骨细胞（Chon:C2）高表达Chad5和Sox5；成骨细胞（Osteo: C10）达Sp7；神经细胞（Neu：C6、C15和C18）表达Dcx和Tubb3；施旺细胞（Sch: C10）表达Cdh19，内皮细胞（Endo：C7和C9）高表达Pecam1和Kdr；免疫细胞（Immu：C14、C17和C19）表达Srgn；上皮细胞（Epi：C16）表达Krt5。Mki67主要在骨骼肌和间充质细胞表达（图2C）。这些结果表明发育过程中Myf5衍生细胞的高度异质性。

不同细胞类型的占比分析发现，在对照组中，大约21.44%的tdT+细胞为肌原性细胞，但在突变小鼠中只有一小部分细胞 (≈1.43%) 属于骨骼肌细胞，此外，间充质细胞在对照或突变小鼠中占据了大约49%的Myf5衍生细胞，但它们在两个样本之间并不完全重叠（图 2D）。这些结果表明SRSF2的缺失显著改变了Myf5衍生细胞的细胞比例。

图2 | scRNA-seq表明Myf5衍生细胞的不同细胞谱系

骨骼肌细胞群体的轨迹分析揭示了在SRSF2缺失的情况下成肌细胞的异常增殖和分化

对骨骼肌细胞的再聚类分析共鉴定出6个不同的骨骼肌亚群，标记为sC1到sC6（图 3A）。sC1细胞表达高水平的Pax7、Myf5和Myod1以及Mki67，定义为活化的成肌细胞；sC2细胞的活化程度低于sC1细胞，因为它们表达的这些标志物水平相对较低；基于分化和成熟纤维标记如p21、Myog和Myh3的表达，将sC3、sC4和sC6鉴定为已分化群体，sC5 细胞，同时表达激活和分化marker，可能代表中间状态（图 3B和C）。同时也发现与对照相比，突变体中已分化细胞的比例增加，活化细胞的比例降低（图 3D）。使用Monocle2分析成肌过程中的细胞转变，发现sC1和sC2在时间起点（pre-b），一小部分在时序分支b2。已分化细胞定位朝向或在主分支（b1）末端和小分支b3，sC5 细胞没有表现出空间偏差。尽管突变细胞数量很少，但它们比对照细胞更倾向于向b1分布（图 3E和F）。在时间开始时观察到Pax7、Myf5和Myod1的高表达，而p21仅限于b1结束，静止marker Gpx3在b2结束时富集，同时Myod1完全丢失，这些结果表明活化的成肌细胞可以进入分化和静止期两种状态。

图3 | 拟时序分析γδ T细胞发育轨迹

作者随后排除了部分静止细胞，主要分析分化过程中基因表达的动态变化（图 4A）。高变基因分析发现下调基因富集MPC marker、核小体组装、细胞周期和DNA复制等，如Pax7、Myf5、E2f1、Kif11、Tfam、Mki6、Esco2，上调基因主要与骨骼肌收缩和纤维发育有关，例如Myog、Ckm和Myh3（图 4B）。两组的表达分析发现，时间顺序上与对照相比，突变组Myf5的表达在早期上调，伴随着中Myog和Cdkn1a水平的增加，然而Pax7首先下调然后快速上调（图 4C），此外，增殖相关基因Tfam、Rad21、Ncapd2和E2F1 均失调，而糖酵解相关基因Eno3、Pgam2、Aldoa和Ldha在突变体中均上调（图 4D和E）。一致地，与对照组相比，突变组细胞骨架相关基因Col1a1、Col3a1、Postn和Dag1下调，压力基因ATF3、Fos,、Hspa1a和Hspa1b显著上调（图 4F和G）。这些结果表明SRSF2缺失的情况下，成肌细胞表现出异常的增殖和分化。

图4 | MKO/tdT和Het/tdT组拟时序高变基因分析

突变小鼠和成肌细胞中观察到祖细胞的早熟分化和缺失

为了验证scRNA-seq的数据，作者首先Pax7和DNA损伤标记物훾H2AX进行免疫荧光染色，发现突变组肌肉Pax7+细胞的数量大大下降，但Pax7+/훾H2A+细胞数量是对照组的10倍以上，表明与对照细胞相比，突变的Pax7+细胞更容易死亡（图 5A）。另外，突变组p21的水平显著增加，Myf5+细胞在KO小鼠中广泛地扩增（图 5B和C）。在原代成肌细胞转染siSRSF后染色结果发现，在SRSF2敲低的细胞中观察到大量Myog+成肌细胞和MHC+肌管，表明SRSF2敲低导致早熟成肌分化，并且分化能力下降，分化的肌管以及未分化的成肌细胞呈现高凋亡率（图 5 D和E），WB结果同样也证实了上述结果（图 5F）。总之，这些结果表明SRSF2敲低会导致原代成肌细胞的早熟分化和细胞凋亡。

图5 | SRSF2的缺失导致成肌细胞异常增殖、耗竭和早熟分化

由于scRNA-seq数据表明p21在突变组肌肉中显著表达上调，作者后续对p21基因进行siRNA干扰。结果发现与siSRSF2转染的细胞相比，p21的下调导致双siRNA（siSRSF2和sip21）转染的细胞中Ki67阳性增加，但对仅用sip21转染的细胞的增殖没有显著影响(图 6A和B)。此外，在双重敲低细胞中观察到Myog和MHC染色减少，表明与SRSF2敲低细胞相比，p21敲低显著挽救了由SRSF2下调诱导的早熟分化(图 6C和D)。这些结果表明在敲除SRSF2会激活原代成肌细胞中p21依赖性途径。

图6 | 敲低p21可以抵消由SRSF2缺失引起的增殖和分化缺陷

研究结论

单细胞转录组测序和实验数据表明Myf5衍生的细胞在肌肉组织细胞谱系的占比比先前描述的要高，并且SRSF2是胚胎肌生成的关键调节因子。SRSF2调节Myf5细胞进入生肌程序，并通过防止早熟分化和细胞凋亡来确保其存活。

参考文献：

Guo R, You X, Meng K, Sha R, Wang Z, Yuan N, Peng Q, Li Z, Xie Z, Chen R, Feng Y. Single-Cell RNA Sequencing Reveals Heterogeneity of Myf5-Derived Cells and Altered Myogenic Fate in the Absence of SRSF2. Adv Sci. 2022 Apr 23:e2105775. doi: 10.1002/advs.202105775.