高通量单细胞测序助力探究肿瘤发生新机制

- 剖析胃癌病变前和胃癌早期潜在的单细胞转录组网络 -

文章：

Dissecting the single-cell transcriptome network underlying gastric premalignant lesions and early gastric cancer

发表期刊：Cell Reports

发表时间：2019.05.07

期刊 IF：7.815

- 文章亮点 -

• 构建了胃癌癌前病变和胃癌早期的单细胞网络

• 检查不同类型细胞在各级病变中的转录动力学：确定了OR51E1是早期恶性病变中内分泌细胞的特异性标记物

• 描述了肠上皮化生过程中杯状细胞的早期形态：鉴定了前杯状细胞簇的标记物HES6

• 识别胃早期恶性细胞的生物标志物：KLK10、SLC11A2、SULT2B1、KLK7、ECM1、LMTK3

- 摘要 -

肠型胃癌以癌前病变为主，包括慢性萎缩性胃炎和肠上皮化生。在这项研究中，研究者通过对胃癌前病变和早期胃癌（EGC）患者的胃窦粘膜活检组织进行单细胞转录组测序，构建了包含32332个高质量细胞的细胞图谱，然后基于不同病变的胃上皮细胞的细胞组成和分子特征构建了单细胞网络。研究者发现在上皮化生过程中，腺体粘液细胞趋向于获得肠样干细胞表型，并确定了OR51E1是早期恶性病变中内分泌细胞的特异性标记物。研究者还发现，HES6可能标记前杯状细胞簇，可能有助于早期化生的鉴定。最后，研究者确定了一组EGC特异性标记，对EGC的准确诊断具有临床意义。这项研究对理解人类胃细胞组在癌前和早期恶性病变的机理提供了独到的见解。

- 背景介绍 -

• 概念

• 化生（metaplasia）：指一种已分化组织转变为另一种分化组织的过程。并非由已分化的细胞直接转变为另一种细胞，而是由具有分裂能力的未分化细胞向另一方向分化而成，一般只能转变为性质相似的细胞。机体的一种组织由于细胞生活环境改变或理化因素刺激，在形态和机能上变为另一种组织的过程，是机体的一种适应现象。

• 肠上皮化生（intestinal metaplasia）：肠上皮化生是指胃粘膜上皮细胞被肠型上皮细胞所代替，即胃粘膜中出现类似小肠或大肠上皮肠粘膜的上皮细胞，其是胃粘膜常见病变，见于多种慢性胃病，特别是慢性萎缩性胃炎。肠上皮化生细胞来自胃固有腺体颈部未分化细胞，这部分细胞是增殖中心，具有向胃及肠上皮细胞分化的潜能。正常时，它不断分化成胃型上皮细胞，以补充衰老脱落的表面上皮；病理情况下，它可分化为肠型上皮细胞，形成肠化生。

根据Correa模型，慢性萎缩性胃炎（CAG）和肠上皮化生（IM）是肠型胃癌（GC）的主要癌前病变。在正常的胃粘膜中，上皮由一系列复杂的细胞系构成，包括黏液细胞、分泌细胞和内分泌细胞，它们协同工作以维持组织的稳态。幽门螺杆菌感染等危险因素对胃粘膜造成损害导致腺细胞的部分乃至全部丢失，最终发展为CAG。在胃炎的发展过程中，IM在粘膜中发展，同时出现了一些化生细胞系，包括肠特异性杯状细胞和肠上皮细胞。因此，细胞特征是鉴别胃癌前病变和恶性病变的关键。

然而，在胃癌的癌前病变和恶性病变的胃粘膜中，不同类型细胞的图谱及其分子特征仍未明确，这阻碍了研究其在胃癌发病机制中的作用。并且以往使用基于大量样本的实验或数学模型来探索胃癌和癌前阶段的分子特征的研究，掩盖了不同细胞群的特征。另外，其他依赖预先确定的标记来纯化细胞群的研究也仅限于几种特定的细胞类型，无法完全区分细胞类型，也无法检测到罕见的细胞体或具有特定状态的细胞。因此，迫切需要对胃癌前和恶性粘膜中单个细胞表达进行全面、系统的研究。

- 材料与方法 -

• 材料

来自9个病人，13个活检组织（涵盖了从胃炎到EGC的病变发展过程）：3个野生浅表性胃炎（NAG）活检组织、3个CAG活检组织、6个IM活检组织、1个EGC活检组织

通过对AB-HID和AB-PAS染色来评估幽门化生亚型，六个IM样本均属于不完全性IM。根据苏mu精和曙红（H＆E）染色以及基于MUC2的免疫荧光染色，IM分为轻度或重度，使用视觉模拟量表对IM的严重程度进行了评分（从0（不存在）至1（轻度），2（中度）或3（显著））。得分为0或1的病例被定为轻度IM病例，得分为2或3的病例被定为重度IM病例。

*标记为幽门螺旋杆菌感染病人。

• 数据分析

· 数据预处理：

• 过滤低质量细胞：1）表达的基因数低于400或高于7000；2）20％或更多的UMI被定位到线粒体或核糖体基因。

• 单细胞基因表达数据标准化处理（Seurat::NormalizeData）

· 降维、聚类和注释：

• 降维：HVG (Seurat::FindVariableGenes ) → PCA（Seurat::RunPCA）

• 聚类：（Seurat::FindClusters）

· 差异表达分析：

• FindMarkers

· 推断胃炎和胃癌的高风险基因：

• CIPHER（根据疾病表型和相应基因之间的网络相关性在全基因组范围内对疾病相关基因进行优先排序）

- 结果 -

• 胃窦粘膜癌前和EGC的单细胞图谱

研究者首先对来自9个病人的13个活检组织进行单细胞转录组测序，质控后最终获得32332个细胞，每个细胞检测的基因数中值为1941个。根据marker基因表达模式识别不同的细胞群，通过降维和无监督聚类的方法，共识别到从NAG、CAG、IM到EGC病变发展过程中的17个主要细胞类群，研究者将其定义为胃粘膜在癌前、早期病变中的单细胞转录组图谱。

在该图谱中，主要包括上皮细胞（EPCAM，KRT18和MUC1）和非上皮细胞（VIM和PTPRC）。其中，上皮细胞主要由胃粘膜上皮细胞组成：胃窦基底粘液细胞（GMC，由MUC6和TFF2标记）、凹腔粘液细胞（PMC，由MUC5AC和TFF1标记）、主细胞（Chief cell，由PGA4和PGA3标记）、肠内分泌细胞（由CHGA和CHGB标记）；还包括增殖细胞（PC，由MKI67和BRIC5标记）、癌细胞（几乎特异性出现在在EGC活检中，由CEACAM5和CEACAM6标记）以及杯状细胞（Goblet cell，由MUC2和ITN1标记）、肠上皮细胞（FABP1和APOA1）、化生干细胞（MSC，由OLFM4，EPHB2和SOX9 标记）等肠化生代表性细胞。

幽门螺杆菌作为胃癌的风险因子，通常通过与胃上皮细胞的密切相互作用和调控其功能而引起CAG或IM。研究者发现胃上皮细胞对幽门螺杆菌感染的反应包括整体表达谱的变化和细胞内在程序与细胞比例的变化。在幽门螺杆菌感染下，胃粘膜内几乎所有细胞类型中的某些基因（包括REG3A，LCN2，COX7B和UQCRB）都持续上调。它还显示了特定细胞类型的模式。例如，在感染幽门螺杆菌的活检组织的GMC中，抗菌素LTF和BPIFB1被特异性上调。他们还研究了在感染幽门螺旋杆菌期间细胞组成的变化，其可能导致整体表达谱变化。将感染的活检组织中的细胞比例与未感染的活检组织中的细胞比例进行比较，发现幽门螺杆菌感染可诱导上皮细胞增殖，从胃粘膜损伤中恢复，并导致胃上皮细胞凋亡。总之，该研究为从细胞内和细胞间的角度研究感染幽门螺旋杆菌的胃上皮相互作用提供了有价值的资源。

• 建立基于单细胞的网络来表征不同病变的胃上皮细胞

然后，研究者关注了上皮细胞从胃炎向胃癌病变级联的变化，观察到PMCs的比例沿病变级联下降，而IM病变中出现的MSCs比例在化生过程中明显升高，EGC病变中MSCs比例最高。此外，他们系统地分析了不同病变上皮细胞的基因表达谱。利用Wilcoxon秩和检验，确定了每个病变中每种细胞类型的差异表达基因(DEGs)（FDR <0.01, fold change >1.5）。然后，研究者在相同的病变中合并了多种细胞类型的DEG作为与病变相关的特征标记，并观察到在具有这些特征标记的不同病变处黏膜中细胞存在明显区别。每种病变中显著富集的信号通路主要涉及胃炎、胃癌，如CAG病变中富集到肿瘤坏死因子(TNF)信号通路和矿物质吸收，IM病变中富集到代谢通路，EGC病变中富集到细胞增殖相关通路。在EGC病变中，细胞增殖相关基因在几乎所有细胞类型中都高度表达，表明细胞增殖是EGC病变中胃粘膜上皮细胞的共同特征。

为了系统化地了解从胃炎到EGC的病变级联中细胞和分子的变化，最终在每种病变中通过表征每对上皮细胞类型之间的系统关联，然后鉴定代表上皮细胞类型的标记基因，构建了单细胞转录组网络。通过蛋白质-蛋白质相互作用将每种代表性细胞类型的标记基因链接在一起，以显示潜在的异质性。另外，展示了每个病变所涉及的整体分子标记的动态变化。该单细胞转录组网络提供了人胃上皮细胞在癌前病变和EGC病变中的系统变化，包括分子和细胞两个方面。

接下来，研究者评估了PMC，GMC，PC和肠上皮细胞的细胞异质性，并发现了一些潜在有意义的亚群，这些亚群反映了每种细胞类型在病理损伤以及胃病理中可能发挥的多种作用。

• 胃粘膜分泌细胞系在不同病变中的单细胞表达谱特征

基于单细胞网络图，胃粘膜分泌细胞是病变间“保守”的细胞类型，主要由PMCs和GMCs组成（其分别由MUC5AC和MUC6标记）。研究者发现这两种细胞类型表现出不同的表达模式，其中PMC主要表达参与肌动蛋白细胞骨架和细菌入侵的基因，而GMC主要表达免疫应答和转化生长因子β（TGF-β）信号传导途径。对于PMC，研究者发现先前与每级病变有关的分子标志在每级病变的PMC中也有相应的表达，包括CAG病变中上调的矿物质吸收，IM病变的代谢，和EGC病变中的氧化磷酸化。

IM病变中以MUC6为标志的GMC细胞具有高度的细胞异质性，可分为两个亚群。亚群1的表达特征富集到与免疫和抗微生物相关的基因，这与正常的肠腺细胞的分子特征相吻合，而亚群2的表达特征主要由肠道干细胞或发育相关的基因组成，包括OLFM4，PHLDA1和LEFTY1。通过在同一IM切除标本上的免疫荧光（IF）染色证实了MUC6和OLFM4以及LEFTY1的共表达模式。据报道，OLFM4可在正常和化生环境中标记肠道干细胞。因此，推测GMC倾向于在IM病变中获得肠道干细胞表型。

接下来，研究者研究了跨不同病变的单个GMC中OLFM4和MUC6的共表达模式的变化。随着胃粘膜的进一步肠化，观察到表达OLFM4的GMC的比例逐渐增加。在EGC病变中，GMC逐渐消失，表达OLFM4的细胞比例达到了峰值，这两者都已被先前的免疫组织化学研究证实。他们进一步评估了IM病变中GMC中MUC6和OLFM4的共表达，发现OLFM4的表达与MUC6的表达呈显着负相关（p = 0.003)。这表明倾向于获得肠样干细胞表型的GMC可能是胃IM和胃肿瘤发生的关键细胞特征。

• 肠内分泌细胞系在不同病变中的单细胞表达谱特征

基于单细胞的网络，肠内分泌细胞是跨不同病变的另一种保守细胞类型。该细胞群具有高度异质性，通过重新聚类共获得八个亚群。然后，研究者研究了典型肠内分泌细胞标志物在不同样品中的表达分布，结果表明不同病灶的内分泌细胞可能以不同的肠内分泌细胞亚型为主。

为了定义每个病变中的肠内分泌细胞亚型，他们分析了内分泌细胞在癌前和癌早期病变中的细胞组成和标记基因表达模式。通过量化每个亚群中表达典型肠内分泌细胞标志物的细胞比例，发现在同一亚群中表达了不同的内分泌细胞标志物，并利用典型细胞标记的主要表达模式来注释这些细胞群。

他们在EGC病变中根据肠内内分泌细胞标志物确定了标记EGC内分泌细胞群的基因，并发现了在EGC病变内分泌细胞中特异性上调的基因，其中OR51E1表达最显著。分别通过对IM和EGC标本进行IF染色，分析了典型内分泌细胞标记物OR51E1和CHGA的表达情况，发现OR51E1在EGC样本中检测到，而在IM样本中没有检测到。在EGC样品中，OR51E1一般与CHGA共表达。因此，推测OR51E1可能是EGC内分泌细胞系的新标记。

• HES6标记早期杯状细胞

IM病变中出现的杯状细胞是临床实践中对胃肠化生进行病理诊断的必要条件。在该研究中，总共565个细胞被归类为“杯状细胞”群（由MUC2和ITLN1等标记），杯状细胞内具有高度异质性，通过将这些杯状细胞重新分为五个亚群并分析其标记基因的共表达，研究者观察到两种主要表达模式，其中一种（P1）被表征为与代谢相关途径有关的基因的上调，另一种（P2）的特征是参与细胞增殖的基因上调。

他们从P2中鉴定到一些尚未与杯状细胞关联的基因，其中包括Hes家族BHLH转录因子6（HES6）。HES6在多种上皮细胞中的杯状细胞中特异表达，并在IM样本一半以上杯状细胞中与SOX4和PROX1转录共表达。此外，还发现HES6在杯状细胞中与分化的杯状细胞标记物MUC2互斥表达，HES6主要在亚群0中表达，而MUC2很少表达。并通过对结肠样品中的HES6进行IF染色加以验证。因此，推测HES6可以标记杯状细胞分化的早期阶段，并可以用于标记某些细胞特征尚未被形态学识别为杯状细胞的细胞，在临床实践中具有鉴别非IM胃炎高危患者的潜力。

为了验证这一点，研究者对结肠样品中的HES6进行了IF染色。观察到，HES6+细胞倾向于位于隐窝的下部的早期分化分泌细胞。然后，他们在IM样本中对HES6和增殖标记物KI67以及分化的杯状细胞标记MUC2进行了IF共染色，发现在表达MUC2的杯状细胞周围存在表达HES6的细胞，并且这些细胞与杯状细胞存在重叠。HES6 +细胞也主要与Ki67 +的增殖细胞混合，但很少有细胞共表达Ki67。据报道，HES6是ATOH1的转录靶标，是上皮内所有分泌谱系产生所必需的。因此，推测HES6可以标记杯状细胞分化的早期阶段，并可以用于标记某些细胞特征尚未被形态学识别为杯状细胞的细胞，在临床实践中具有鉴别非IM胃炎高危患者的潜力。

• 单细胞转录图谱可识别EGC细胞的特异性标记物

EGC是一种局限于粘膜和粘膜下层的病变，5年生存率为>90%，因此识别潜在的胃癌早期检测标志物至关重要。在此，研究者重点研究了“癌细胞”群，并对其表达谱进行了表征并证实了细胞簇中的细胞为EGC细胞。然后，他们关注了癌细胞群和其他细胞群之间的转录相关性，计算了不同上皮细胞类型之间的相关性得分，并将它们可视化在一个网络中。结果表明，癌细胞簇与MSC簇和肠上皮细胞簇的转录相似性最大，这与肠型胃癌（GC）的特征相符。

研究者基于单细胞图谱，经过分析获得6个EGC相关主要标记基因，其中尚未报道SLC11A2和KLK7参与胃肿瘤的发生。分别通过IM、EGC和晚期胃癌(AGC)活检的IF染色，对表达上调最多的KLK10基因进行了验证。KLK10在IM样品中呈阴性，在EGC样品中呈中度表达，在AGC样品中呈强表达。因此，推测这些基因可以作为癌症细胞特异性分子标记，能够在临床实践的早期阶段准确识别GC细胞发育的开始。

- 讨论 -

在该研究中，研究者构建了胃癌前和胃癌早期的单细胞转录组图谱（这可能是第一个详细定义NAG，CAG，IM和EGC患者胃粘膜单细胞图谱的研究）。对于每级病变，他们对不同细胞类型的表达模式进行了表征，并分析了它们在病变中的变化。此外，深入分析了杯状细胞和肿瘤细胞，分别是IM和GC发作的细胞特征。鉴定获得一组早期肿瘤细胞特异性标记基因，为精确诊断EGC提供了分子基础。该研究为胃粘膜具有不同类型的癌前病变和恶性病变的细胞异质性提供了有力的支持，这可能有助于确定癌症预防标志物，并有助于了解GC发病机理。

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