高通量测序数据上传指南

引

很多老师在写文章的时候，精力通常会放在文章中的技术或者实验细节，而疏忽原始数据上传的工作。文章准备接收时，审稿人需要老师提供文章中使用数据的登录号，一般时间要求较紧，对于没接触过数据上传的老师来说，可能会成为文章接收最后的绊脚石，为此我们撰写了一份高通量测序数据上传指南，可以让老师快速掌握数据上传的技能，助力老师文章发表。

目前高通量测序原始数据通常上传到NCBI的SRA(The Sequence Read Archive)数据库，部分老师会纠结是否需要把测序数据上传至GEO数据库，这里无需多虑，因为测序数据上传到GEO之后，最终也是存放在SRA；而且SRA相对于GEO来说，上传过程更快速、便捷。

本指南以上传SRA数据库为例，整体篇幅以截图为主，并辅以文字描述，方便老师对照网页操作。

在数据上传过程中可能会要求填写实验细节，有些可能不明确或者不适用，如果没有特殊需要，部分细节可以不用过于纠结。数据成功上传后会生成一个Accession Number，最终加入文章中，审稿人或者其他人能够通过该Accession Number查询、下载到对应数据。

话不多说，直接上干货~

01

登录/注册

1.1 进入NCBI数据上传主页

主页链接

https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/，如图：

Sequence Read Archive：填写样本信息、上传样本数据

BioProject：填写项目信息

BioSample ：填写样本属性

1.2 Login in/Register (有账号可以跳过1.2和1.3)

点击右上角Login，如果在NCBI注册过，可以输入账号密码登陆，如果未注册可以点击Register for NCBI account注册：

1.3 验证邮箱

注册完毕后会向所填写的邮箱中发送验证邮件，点击邮件中的链接即可激活账号。再次回到第二步之后的界面，此时会自动登录。

注：提交过程中如果出现以下的登陆方式选择，一律选择NCBI PDA登陆

02

创建研究项目-BioProject

回到上传主页

https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/，点击BioProject：

页面跳转后点击New submission：

2.1 SUBMITTER

进入创建BioProject页面Submitter选项卡，填写必要个人信息：

2.2 PROJECT TYPE

在Project Type选项卡中依次选择相应的类别，此处以普通转录组测序为例，勾选原始测序数据：

2.3 TARGET

进入Target选项卡，填写物种名称 (此处填写的物种拉丁文名称需在NCBI中有收录，输入关键词后选择弹窗的物种信息，否则会提示找不到该物种名)，继续下一步：

2.4 GENERAL INFO

进入General Info选项卡；第一个选项是问此数据是否马上发布，还是指定特定日期发布(释放日期可以给NCBI写邮件更改)。其他填写带星号的必填内容，继续下一步：

2.5 BIOSAMPLE

进入BioSample选项卡，需要指定项目中包含的BioSample，可以先略过，也可以先去创建BioSample。此处先略过，点击继续：

2.6 PUBLICATIONS

进入Publications选项卡，如有已发表文章，可以指定PubMedID或DOI，没有请略过：

2.7 OVERVIEW

最后Overview中可以浏览概况，确认无误后点击Submit提交：

2.8 获得PRJ ID

提交后会回到BioProject界面，列表中会显示刚才的项目已经提交正在审核(Awaiting processing)。一般几分钟就能审核完毕，刷新就可以看到Processed，并可以看到BioProject编号 (PRJ开头)：

03

创建生物样品-BioSample

回到上传主页https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/，点击BioSample ：

页面跳转后点击New submission：

3.1 SUBMITTER

进入创建BioSample页面Submitter选项卡，填写/完善必要的个人信息：

3.2 GENERAL INFO

在General info选项卡中，第一个是选择是否立即发布(和上面的Bioproject的类似)，第二个选择是问是否有多组样品，如果选多组样品的话，会要求上传表格文件，用于描述各样品的属性，比较繁琐；可选择单样品，不影响后续上传：

3.3 SAMPLE TYPE

在Sample Type选项卡中根据样本实际情况选择：

3.4 ATTRIBUTES

Attributes选项卡，按情况填写星号内容(此处Sample Name可以自行填写，物种信息参考上面Bioproject的操作，填写完整的拉丁文名称-需要下拉列表有显示对应的物种名)：

3.5 BIOPROJECT

BioProject选项卡，输入刚才创建的BioProject编号：

3.6 DESCRIPTION

Description选项卡，信息如果不需要更改按照默认的即可：

3.7 OVERVIEW

最后Overview中浏览概况，确认无误后点击Submit提交：

3.8 获得SAM ID

提交后会回到BioSample界面，列表中会显示刚才的项目已经提交正在审核(Awaiting processing)。一般几分钟就能审核完毕，刷新就可以看到Processed，并可以看到BioSample编号 (SAM开头)：

04

创建SRA

回到上传主页

https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/，点击Sequence Read Archive：

页面跳转后点击New submission：

4.1 SUBMITTER

进入创建SRA页面Submitter选项卡，填写/完善必要个人信息：

4.2 GENERAL

在General选项卡里，选择前面创建的BioProject，是否已经创建好了BioSample选择Yes，发布日期根据实际情况选择：

4.3 METADATA

在Metadata选项卡，填写提交数据的相关实验信息，这一步可以直接在网页上填写，示例如下：

也可以下载模板表格填好之后再上传：

*Filetype如果只有fa文件也可以选择fastq格式(NCBI会默认上传的fa文件碱基质量值为30)

*Filename填写的文件名称必须和上传的序列文件名称一致(后台通过表格信息关联上传的数据，如果名称不一致会提示文件缺失)，如“Filename”、“Flename2”分别填写了Sample_A.R1.fastq.gz、Sample_A.R2.fastq.gz，那么该样本的R1、R2端数据的文件名也必须是Sample_A.R1.fastq.gz、Sample_A.R2.fastq.gz。

4.4 FILES

在Files选项卡里，对于上传数据的方式，我们通常选择FTP or Aspera Command Line file preload：即使用FTP工具(Filezilla)或命令行传输(ascp)：

4.4.1 FTP传输-Filezilla

下载Filezilla(https://www.filezilla.cn/download/) 安装好之后并做如下设置：

根据网页提供的FTP地址、账号、密码用Filezilla连接上服务器。如果一直读取目录失败，可以直接将3. Navigate to your account folder下面的目录(如“uploads/upload@oebiotech.com_hzWLqygv”)复制进Filezilla的远程站点里(注意路径要以斜杠“/”开头)，然后回车键就能进入目录了，进入目录后再创建一个子目录并进入(如果上传的数据不在新创建的子目录中上传的文件不会被检测到！)：

将数据文件直接拖进右侧区域(新创建的子目录)等待上传完毕：

4.4.2 命令行传输-Aspera 上传/ascp

往SRA上传输数据的时候，有时会遇到Filezilla传输慢的情况，这时候就需要Aspera软件帮忙了。

软件官网下载链接：

https://downloads.asperasoft.com/en/downloads/62

网盘下载链接：

Windows：

https://pan.baidu.com/s/1OKgPKs2nEUH1ubuxAhXH8A 提取码: yw24

Mac OS：

https://pan.baidu.com/s/18oQ36MdNuMTm6OGUVJQJuw 提取码: gy55

下载好解压缩即可，解压缩的路径一会要用到，例如D:\Aspera\cli\bin

Aspera环境变量设置(以windows为例)：右键我的电脑-属性-高级设置-环境变量设置-PATH里添加软件的路径(D:\Aspera\cli\bin)

windows 键+R 弹出运行框，输入cmd 回车进行进入cmd界面，输入ascp –h可正常显示 ：

在Aspera command line upload instructions ，可以查看到命令行：

注意命令行中提及的key_file(上图红圈部分)点击下载key文件aspera.openssh并存放在指定位置，如 "D:\Aspera"；数据上传完整命令如下：

ascp -i D:\Aspera\aspera.openssh -QT -l100m -k1 -d F:\upload_OE-data subasp@upload.ncbi.nlm.nih.gov:uploads/upload@oebiotech.com_3pZCtpnp/upload_OE-data

-i 之后填写前面下载的aspera.openssh文件的绝对路径("D:\Aspera\aspera.openssh")

-d 之后填写需要上传的数据文件的路径，这个路径下除了待上传的原始数据最好不要存放其他文件("F:\upload_OE-data")

"空格"之后接NCBI的远程路径

("subasp@upload.ncbi.nlm.nih.gov:uploads/upload@oebiotech.com_3pZCtpnp/upload_OE-data")

远程路径后面需要添加一个子目录("upload_OE-data")，否则上传的数据检测不到！

命令输入后回车显示传输，等待提示传输完毕，传输中断可重复之前的命令。

数据上传成功之后(这一过程消耗的时间根据文件数量、大小及网速决定)做如下操作：

确认没问题，点击继续：

4.5 OVERVIEW

最后Overview中浏览概况，确认无误后点击Submit提交：

05

完成上传

可以在

https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/sra/查看审核状态：

目前测序数据上传完成。NCBI会在后台审核数据，最后给出Accession Number，一般一天左右。

审核完毕的数据可能不会马上被NCBI收录，一般需要2-4天才能被搜索到(如果设定了发布时间，则在发布时间之后才能搜到)。可以在SRA的Submission中(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra_sub/?login=pda)查询到目前的审核进度。

注意最终使用的Accession Number一般为Run的编号，SRR开头。可以点击Submission Id进入查看Accession Number：

Tips：上传过程中遇到任何问题(如下图的报错信息)可以直接邮件联系NCBI请求帮助(邮箱：sra@ncbi.nlm.nih.gov)

至此，整个数据上传就已经全部完成了；Accession Number放进文章，完成文章接收的最后一步。

SRA数据上传的界面会时有更新，我们也会定期跟踪，及时更新，确保本指南的实用性。

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