单细胞测序技术分享 | 乳腺癌细胞多样性

Profiling human breast epithelial cells using single cell RNA sequencing identifies cell diversity

前 言

乳腺癌是一种具有高度异质性的疾病，由发生基因改变的乳腺上皮细胞引起。虽然已经鉴定出了几种不同的上皮细胞亚群，但目前对人类乳腺的异质性和分化层次仍未完全理解。了解乳腺癌在其早期阶段的起源有可能促进癌症早期检测方法，并最终形成预防癌症发展的基础。本研究用单细胞mRNA测序技术对人乳腺上皮细胞的细胞类型和状态进行分子普查，以对乳腺上皮细胞的分化轨迹及其与癌症形成的关系提供依据。

实验方法

本文用两种方法进行单细胞测序：Fluidigm C1和10× Genomics。

Fluidigm C1检测3个个体（正常，无疾病）的868 细胞，每个细胞1.6M reads；10× Genomics对另外4名个体（正常，无疾病）进行测序，5000 cells/sample，60,000 reads/cell。

结果分析

1、Fluidigm C1 scRNAseq揭示乳腺上皮细胞有3中细胞亚型

基质细胞和腔细胞分别加载到Fluidigm C1微流体scRNAseq平台。

乳腺上皮细胞由3种主要的细胞亚型构成：基质细胞、腔细胞1、腔细胞2。对每个群集中显著上调的基因进行研究发现，这些主要的簇对应于一个主要基底细胞类型(KRT14+)和两个均表达典型KRT8和KRT18的管腔细胞类型。

之前的研究发现基质细胞中包含乳腺干细胞（MaSCs）亚群，因此对基质细胞cluster进行详细探究。

作者观察到了间充质和干细胞marker ZEB1和TCF4表达量增加的亚群。之前的研究建立了间充质基因表达特征和乳腺干细胞能力之间的直接联系，表明这些ZEB1/TCF4表达细胞可能代表了能增强乳腺干细胞潜能的基质细胞亚群。

2、10× Genomics测序揭示了细胞亚群多样性

3种主要的细胞类型：基质细胞、腔细胞1、腔细胞2，及其对应的marker gene：KRT14、KRT18/SLP1、ANKRD30A/SLP1。

每个主要的上皮细胞类群中均出现了多个亚群，我们假设，主要的细胞岛（基质，L1，L2）代表不同的“细胞类型”，而每个岛内的亚型描绘随着时间的推移更加短暂的“细胞状态”。基质细胞有3个不同的细胞状态：炎症介质特异性表达-cluster3、肌上皮细胞功能marker-cluster4、特异性上皮角蛋白表达-cluster5。

3、细胞类型和状态的空间整合

（1）基质细胞

ZEB1蛋白在基质上皮细胞中表达了。高ZEB1和中等KRT14与之前研究的鼠的结果相似，表明ZEB1+基质细胞可能代表人乳腺干细胞的一个群体。

TCF4在基质上皮细胞中表达，且与ZEB1有相似的染色模式。

ZEB1和TCF4表达的细胞状态存在于完整乳腺组织的基底区内。

KRT14主要在基质细胞，尤其Myo中表达。KRT14主要定位于到导管区域内的基质细胞层，而在小叶基质细胞中显示更低和更可变的着色。

（2）两种腔细胞

L1和L2在导管和小叶内彼此相邻。

KRT8在L2中表达最高。Single cell western鉴定基质和腔细胞的蛋白表达，表明Single cell western可以用于单细胞测序分析的下游验证工具。

4、上皮细胞谱系层次的重构

为了理解细胞类型及其状态之间的相互关系，通过拟时间排序重构了分化轨迹。

4个个体的样本群体产生了一个紧密相连的分化轨迹，分成三个主要分支，分别对应主要细胞类型Basal、L1和L2。这表明该系统是通过一个连续的谱系、而不是几个间断的谱系来维持的。

结论

本研究从单细胞水平对人乳腺上皮细胞异质性的光谱提供了深刻理解。对七个个体的单细胞基因特征的无偏分析提供了维持人乳房内平衡的分化轨迹的证据。本研究绘制的包含人乳腺上皮细胞的单细胞图谱，可以作为绘制乳腺癌期间体内变化的资源，从而改进癌症早期检测的方法和癌症预防策略。