酵母双杂交经验谈

1、 酵母单杂能不能用mating的方法？
不能，因为Y1HGold和Y187都是α型，不能融合生长。

2、 细胞质蛋白用哪种方法筛库？
可以用核体系也可以用膜体系，最好用膜体系。

3、 共转是把AD转到带有BD的Y2HGold还是BD、AD一起转到Y2HGold?
都可以,如果是AD转到带有BD的酵母菌用SD-trp的培养基摇菌。

4、 筛到的蛋白经测序后，从AAA AAA后翻译的结果有好多都移码？
三框文库不是不移码，而是保证您的文库中的每个基因的克隆都至少有一种不移码的情况存在，即您的文库表达的目的蛋白中总有正确的蛋白存在。 所以出现移码情况需要分析测序峰图而不是只看测序结果，也许峰图上有某个位点缺失导致序列移码，这种情况需要手动调整序列。理论上肯定只有不移码的基因才会被筛选出来。

5、如果诱饵蛋白对酵母细胞是有毒的，该怎么办？
    在某些情况下，在液体培养基中培养不好的菌珠可以在固体培养基上生长得很好。首先重悬克隆于1ml的SD/–Trp，接着将重悬液平铺于5 个100-mm的SD/–Trp平板，在30℃下温浴，直至平板上的克隆相互粘在一起。用5ml 0.5X YPDA刮下每块板上的克隆，并收集到一管中，这样就可以使用这个细胞重悬液进行正常的杂交反应。

6、如果诱饵蛋白能直接激活报告基因的表达，该如何处理？
      该蛋白很可能有转录激活域，是个转录因子。可以通过基因重组切掉转录激活域，然后重新检测其是否自激活，但要注意重组也有可能破坏蛋白之间的互作。

7、转化效率太低怎么办？
     可以采用以下方法解决：
1) 检测一下DNA的纯度，如果可以的话，重新用乙醇纯化。
2) DNA-BD/诱饵蛋白很可能是有毒的。
3) 不适当的培养基，重新配制培养基，并做对照转化。
4) 检测pGBT9对照载体的转化效率，放置于SD/–Trp平板上，转化效率应该在1 x 105 colonies/ug DNA以上。

8、杂交效率不高，该如何处理？
      在杂交中，预转化的诱饵细胞的数量可能不够。当对诱饵菌株进行液体培养过夜时，应挑选大的、新鲜的克隆进行培养，经过离心和重悬后，再使用血球计对细胞进行计数。密度应该在1 x 109/ml。
      一个甚至两个融合蛋白对酵母细胞有毒。你可以通过重组方法来减轻毒性，同时又能保证蛋白的相互作用。或者使用表达水平较低的载体。也可以在琼脂平板或滤膜上进行杂交。但同时必须作杂交对照实验。

9、四缺板上筛选到的阳性克隆可以直接拿菌液或酵母质粒去测序吗？
   不行，因为酵母质粒拷贝数低，达不到测序浓度，所以需要将抽出的质粒转到大肠杆菌再测序。

10、膜系统酵母双杂文库如何选择BD载体？
膜系统酵母双杂根据诱饵基因的蛋白跨膜方式选择不同的载体，可以根据如下网站预测蛋白结构进行选择：
http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/phobius/
http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/
上面的这两个网站可以分析膜蛋白的细胞内和细胞外区域。
http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/
这个网站可以具体分析蛋白的信号肽序列，以及N端是否存在cleavge site。
确定诱饵基因的蛋白结构以后根据如下表格选择适当的载体：

 

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