项目文章 | 中国科学院科学家拟南芥新文喜登The Plant Journal

基本信息

英文标题：Genome-wide binding analysis reveals that ANAC060 directly represses sugar-induced ABI5 transcription in Arabidopsis

中文标题：全基因组结合实验表明 ANAC060 直接抑制拟南芥中糖诱导的 ABI5 转录

发表期刊：The Plant Journal

发表时间：2020.04.20

影响因子：5.726

作者单位：中国科学院分子植物科学卓越创新中心滕胜研究组和张一婧研究组

本文涉及的高通量技术：表达谱芯片由欧易生物提供

研究背景

作为光合作用的产物，糖不仅为生命活动提供了物质基础和能量载体，而且生物体内糖丰度可以通过糖分子等介导的多个信号途径调控其生长发育、光、植物激素、胁迫、植物防御和营养反应等。在植物中，利用高浓度糖抑制拟南芥幼苗生长的研究体系，揭示了糖-脱落酸（ABA）级联途径在糖信号传递过程中具有重要的作用。转录因子家族NAC参与植物发育和对生物和非生物胁迫的反应，ANAC060被证明在糖敏感性中起着重要作用，但是NAC-TFs影响糖敏感性的分子机制尚不清楚。

研究内容

本研究采用染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq），对ANAC60进行全基因组靶向分析。通过对葡萄糖处理下野生型（WT）植物和anac060 突变体（MT）进行转录组分析，确定了ANAC060的靶基因，进一步分析发现ANAC060可以特异地结合到ABI5 启动子的G-box元件并抑制ABI5 的表达，降低糖和ABA的敏感度。

研究路线

研究结果

1、全基因组表达谱芯片分析糖刺激ANAC060结合位点

首先，作者构建了anac060 突变体和35S:ANAC060-GFP/anac060 转基因植株，利用GFP和DAPI共定位，发现ANAC060定位于细胞核（图1a），且与WT-Col葡萄糖敏感性相似（图1b），表明ANAC060-GFP融合蛋白具有内源性Col-ANAC060蛋白的生物学功能。

通过染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq），在全基因组水平上，鉴定出2860个ANAC060结合位点，近端启动子区域富集显著（约占总数的70.07%），且在TSSs上游200bp上达到峰值（图2a-2b）。对ANAC060结合motif±500bp分析发现G-box元件高度富集（约34%的结合位点含有一个或多个典型的G-box motif）（图2c），EMSA证实ANAC060可以直接靶向G-box元件（图2d），表明ANAC060主要通过结合G-box元件调控下游基因的表达。

对2860个位点关联到的3282个靶基因进行GO分析发现，靶基因主要参与生物和非生物胁迫响应，并与16个ABA-TFs的靶基因高度重叠，重叠基因约占ANAC060靶基因33.6%~65.8%。

图1 | ANAC060-GFP融合蛋白具有内源性Col-ANAC060蛋白的生物学功能

图2 | ANAC060主要结合G-box元件

2、ANAC060缓解了葡萄糖引发的转录体表达量改变

为进一步分析NAC060在ABA-糖信号通路中的作用，作者使用全基因组基因表达分析（Agilent Arabidopsis Microarray 3.0）分别对WT和anac060 突变体在葡萄糖处理和山梨醇渗透对照处理下进行检测，结果发现相较于山梨醇处理，葡萄糖处理下anac060 突变体的表型变化显著性大于WT，差异表达基因数目约为WT的3倍(5955 vs 2112)。与WT相比，anac060 突变体差异表达基因增加了近5倍（葡萄糖处理/山梨醇处理，差异基因4484/918）。通过聚类分析发现，ANAC060上调了73.9%的葡萄糖下调基因，并下调了65.9%的葡萄糖上调基因的表达，表明ANAC060在糖-ABA级联途径中起衰减作用 （图3a）。

分别对上调和下调的差异基因进行韦恩分析，发现926个糖诱导且在ANAC060下调的基因主要参与休眠、脂质贮藏、ABA反应、种子萌发、乙（yi）烯反应、水分剥夺反应、DNA依赖性DNA复制、萜类化合物生物合成过程中富集，对冷冻和赤霉素生物合成过程的响应等；而1806个糖抑制且在ANAC060上调的基因主要参与叶绿体类囊体膜、叶绿体类囊体、光合作用、光反应、类囊体、对硝酸盐的反应、硝酸盐运输、质体组织、光系统II组装和rRNA处理等（图3b-3e）。

图3 | 全基因组分析ANAC060在糖诱导下基因表达谱差异

3、ANAC060激活和抑制基因的功能分析

对基于ChIP-seq得到的3282个ANAC060靶基因与基于表达谱芯片得到4484 个葡萄糖处理下ANAC060调控基因进行比对，得到500个ANAC060直接调控的靶基因（215个上调，285个下调）（图4a）。在215个ANAC060抑制基因中，113个基因的表达受到葡萄糖的上调，GO分析主要参与ABA反应、水分剥夺反应、种子休眠过程、ABA激活信号途径、蛋白质结合和脂质储存，其中包含2个ABA相关信号通路（含ABI5在内的23个基因）。285个ANAC060激活基因中，199个基因的表达受到葡萄糖的下调，GO分析主要参与硝酸盐反应、硝酸盐转运、二价金属离子转运、细胞阳离子稳态、叶绿体类囊体、叶绿体类囊体膜、环戊(wu）烯酮反应、光合作用、光反应有关，类囊体和吲哚-3-乙酸合成酶活性等，其中8个与叶绿体和光合作用有关（含RBSC、CAB和PC）（图4b-4e），推断这些GO与anac060 突变体的糖超敏感表型相关。

图4 | ANAC060激活和抑制基因的功能分析

4、ANAC060直接抑制ABI5 表达

基于前面的研究，ANAC060可以结合ABA信号通路中的关键分子ABI5的启动子区域，并通过ChIP-qPCR得到验证（图5a-5b）。ABI5启动子区有4个G-box基序，分别通过EMSA验证，表明ANAC060主要结合的是ABI5（TSS上游-172到-227 bp）（图5c-5d）。qPCR检测发现，与WT相比，ABI5在葡萄糖诱导的anac060 突变体中表达显著增加，而在anac060 突变体中引入35S:anac060-GFP，降低了葡萄糖诱导的ABI5表达的活性（图5e）。这些结果表明葡萄糖处理下ANAC060抑制ABI5的表达，并进一步在烟草叶片中进行荧光素酶报告实验得到验证（图5f）。

图5 | ANAC060直接抑制ABI5表达

5、anac60/abi5 双突变体对葡萄糖和ABA不敏感

作者分别又构建了abi5 突变体和anac060/abi5 双突变体，结果发现anac060 突变体表现出葡萄糖超敏感，abi5 突变体则对葡萄糖和ABA不敏感，而anac060/abi5双突变体表现出与abi5 突变体相似的葡萄糖和ABA不敏感表型（图6a-6d）。这些结果表明，ANAC060对ABI5的抑制作用是导致糖和ABA不敏感的原因之一。

图6 | ANAC060对ABI5的抑制作用是导致糖和ABA不敏感

研究结论

该研究阐明了拟南芥NAC家族转录因子ANAC060负调控糖-ABA级联信号途径的分子机理，ANAC060结合ABI5 启动子G-BOX motif，抑制ABI5 的转录，参与植株对葡萄糖和ABA耐受。

ANAC060调控ABI5 表达的作用模型

参考文献

Yu B, Wang Y, Zhou H, et al. Genome-wide binding analysis reveals that ANAC060 directly represses sugar-induced ABI5 transcription in Arabidopsis. Plant J 2020; doi: 10.1111/TPJ.14777.

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