万万没想到麻雀是高粱单宁含量高、人类苦味味觉弱的“始作俑者”

基本信息 

文章标题：Allelochemicals targeted to balance competing selections in African agroecosystems

发表期刊：Nature Plants

刊登时间：2019.12.02

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41477-019-0563-0
 

背景和主要结论 

鸟害是影响作物产量的重要因素之一，尤其红嘴奎利亚雀对非洲农作物的生产造成灾难性的影响。余建明教授等发表在Nature Plants上的研究发现，无单宁高粱的鸟害程度与株高呈正比，含单宁高粱的鸟害程度与株高无关。通过非洲的群体发现，东非和南非的鸟害非常严重，而高粱在东非和南非的单宁含量高，说明高粱为了抵抗当地严重的鸟害而保留了单宁含量高这一特征，与之相反的是，西非的单宁含量低，同时西非的鸟害程度较弱。含单宁高粱与红嘴奎利亚雀呈现平行分布，揭示了单宁在高粱对抗捕食者的过程中发挥了重要作用。对非洲人群的遗传研究发现，东非和南非的人群苦味味觉较弱，而西非的苦味味觉受体发达。该研究揭示了由单宁引导的作物（高粱），人类（味觉），环境（鸟害）三者之间的驯化三角关系。 

“挑食”的麻雀 

故事要从高粱试验田中的一群麻雀开始说起。研究人员选用了两个品种，Tx430和P898012构建了一个RIL群体，种植在高粱试验田（图1a）中，试验田由光周期敏感的高大茂盛的高粱围成。季末，研究人员发现了一些RIL个体在大部分的籽粒被麻雀吃掉之后，花序颜色变黑，只留下了颖片。同时，另外一些RIL还是完整的，只有少部分的籽粒被麻雀吞食，说明麻雀「挑食」，不喜欢这些籽粒（图2）。收获之后发现，受鸟害轻的RIL每个花序的籽粒平均重量68g，而受严重鸟害的RIL平均重量只有3g（图3）。
 

图1 | 高粱试验田概况

图2 | 高粱与麻雀

图3 | 受鸟害程度不同的不同高粱籽粒

他们马上对整个RIL群体进行了鸟害程度的评估，用0-10打分来评估受鸟害程度的差异（10分表示籽粒全部被吃，0分表示没有被吃），发现两个重复间的Pearson相关系数为0.83， 说明麻雀对高粱的偏好，不是随机现象，而是遗传导致的。通过QTL作图，发现高粱基因组上有五个显著信号，其中三个与已报道的植物高度QTL重合（qHT7.1 , Dw3 ,Dw1，图4g）。长得高的高粱更容易被麻雀吃到，所以受鸟害程度更高。为了找到2号和4号染色体上另外两个信号的可能基因，他们再次检查不同鸟害程度的剩余种子。受轻微鸟害的种子的外种皮有颜色，说明单宁含量高。所以他们进行了第二次表型考察，用0/1代表有无单宁，以此来观察鸟害，植株高度，单宁含量三者的关系。单宁含量与植株高度（两个无显著相关的特征，Pearson系数，r=-0.018，P=0.78），共同解释了麻雀偏好性状的63%的变异。

不管植株多高，单宁的存在导致麻雀不去吞食高粱，但是对于没有单宁的高粱，高大的植株更倾向于被吞食。同时，单宁含量的QTL定位结果与鸟害定位到了相同的区间，而且，没有单宁，高粱更容易受鸟害。

图4 | 鸟害，单宁和植株高度的QTL定位结果

叠加隐性上位的Tan1 和Tan2 共同调控单宁含量

4号染色体的QTL区间包含Tan1 ( Sobic.004G280800 )，不包含单宁的亲本Tx430携带tan1-a等位（编码区1bp的插入，图5a）。通过测序证实另一个亲本（P898012）携带显性等位Tan1。

2号染色体的QTL区间包含六个基因，其中Sobic.002G076600 编码一个bHLH蛋白，是拟南芥TT8，水稻Rc和玉米中IN1的同源基因，参与苯丙(bing)烷合成通路。Sobic.002G076600 上的第7个外显子发现一个移码突变（Tx430中 存在5-bp CTCCC 插入，图5a），而其它五个基因都没有找到功能丧失的突变。将P899012的部分编码序列（包含bHLH结构域，图5b）序列转入到拟南芥tt8 突变体中，恢复了种子棕色颜色和单宁合成（图5b）。以上所有证据都说明Sobic.002G076600 是Tan2 的基因，同时亲本P898012携带显性等位。

经典遗传学表明高粱籽粒的单宁含量由一对叠加隐性上位基因控制（B1和B2 ），也就是说任一基因的纯合隐性位点都会导致植株无单宁。RIL群体中发现单宁:无单宁比例为1:3（59：175，图5c），符合RIL群体比例。Tan1 和Tan2 的明显的互作关系（LOD值 108，图5d）支持它们之前经典遗传学猜测的两个对应基因。

图5 | Tan1 和Tan2 的基因结构和验证

更多大规模群体中的验证

研究人员通过962个品种的340,496个SNP数据集，继续评估有无单宁这一性状。GWAS鉴定到了4号染色体的Tan1，同时2号染色体上，一个落在Tan2 上游12kb的SNP是第二显著的信号（图6a）。由于Tan1 和Tan2 共同作用于单宁性状，Tan1 的两个天然隐性等位（tan1-a 和tan1-b）的发现，说明两个基因不同的关联信号可能是由于等位基因频率造成的。

研究人员对180个高粱品系（92个含单宁，88个无单宁）的Tan1 和Tan2 的基因和上游启动子区域进行了测序，他们发现了61个MAF从0.006到0.497的多态性位点。Tan1 区域的29个多态性位点中发现了tan1-c，第三个隐性等位，编码区域1bp的缺失。另一个在单个基因座位分离的RIL群体中的强烈QTL信号证实了tan1-c 是一个无效等位。Tan2 的32个多态性位点中，除了Tx430中检测到的5bp插入（命名为tan2-a ），还发现了另外两个隐性等位，分别是第七个外显子上8bp的插入（tan2-b ）以及第七个和第八个外显子中间95bp的内含子缺失（tan2-c ）。

180个品种的panel中，Tan1 的多态性位点比Tan2 的位点有更强的关联信号。六个致因突变（casual variants）中，只有tan1-a 的MAF超过25%，超过了GWAS阈值线。其它五个无效等位由于较低的MAF，从1%到13%，都比阈值线低。

为了将生物学上的视角引入统计学模型，研究人员做了基于单倍型的关联分析。每个基因上的三个隐性等位，进行四种比较，分别是：野生型 vs a+b; 野生型 vs a+c;野生型 vs b+c;野生型 vs a+b+c。基于单倍型的关联得到了更强的关联信号。同时Tan2 的所有低频隐性等位得到了显著关联信号。88个无单宁的品种中，63个有隐性的tan1Tan2，12个tan2Tan1 和13个tan1tan2。只考虑两个稀有等位，tan1-b 和tan2-b 的话，P值只有0.001。当六个致因突变都考虑的时候，关联的P值达到了 3.5x10-50（图6 b）。

研究人员随后在非洲种质资源库中的11,557份高粱中评估了单宁含量。大约55%的单宁高粱，45%的无单宁高粱，说明非洲存在不同的农业系统运行方式，而其它大洲的通常只保留无单宁的粮食作物。

图6 | GWAS定位结果和基于单倍型的分析

单宁高粱与粮食作物之间的选择

一般来说，驯化过程为了拿到可口的高粱籽粒，选择是倾向于摒弃单宁高粱。所有野生高粱品种都含有单宁，同时在两个基因座位上都是显性位点。根据驯化明星基因-落粒基因 Shattering 1 (Sh1) 的地理分布，非洲内部存在三次高粱的驯化起源。为了探究单宁高粱的驯化历史，研究人员对61份之前用来研究Sh1 的非洲地方种进行了Tan1 和Tan2 的分型。39份单宁地方种携带Tan1 和Tan2，三个sh1的等位（sh1Tx430，sh1SC265，sh1Tx623）的等位基因频率相近。剩下的22份无单宁的高粱中，59%是Tan2tan1 的组合（38%是tan1-a，62%是tan1-c），41%是Tan1tan2 组合（33%是tan2-a，66%是tan2-c）。三个sh1的等位基因在无单宁的高粱中频率分布差异很大（66% sh1Tx623 ，22% sh1SC265，11% sh1Tx430）。tan1-b 和tan2-b 均未检测到，与之前180个品种中频率低表现一致。同时，地方种也不存在tan1tan2 的组合，毕竟只要一个基因是隐性就是无单宁高粱，与180个品种只有7%的高粱同时含有两个隐性等位结论一致（图7.1 a）。

研究人员又分析了非洲地方种致因突变的地理分布。带tan1-a 的地方种来自于主要是sh1SC265的东非和西非，而tan2-c 的品种来自主要是sh1Tx623的南非。tan1-c 在西非频率很低，同时东非没有tan2-a 的品种。地理分布与FST 的计算结果一致（图7.2 b）。tan1-a 的FST 为0.6，而其它位点低于0.2。所有结果说明对于无单宁高粱的选择可能是个多起源的事件。

图7.1 | Tan1 Tan2 和Sh1 的单倍型统计

图7.2 | Tan1，Tan2 基因型和单宁高粱的地理分布

单宁高粱和红嘴奎利亚雀( Q. quelea )的平行地理分布

单宁高粱可以提前萌发，防止鸟害，籽粒发霉。与其它谷物的籽粒被外壳或者外种皮完全包裹不同，高粱的籽粒缺乏颖片的保护层，直接暴露给捕食者。红嘴奎利亚雀的种群大小上亿，是非洲最多最具破坏性的害鸟。已有实验室报道单宁与红嘴奎利亚雀的食性偏好负相关。除几内亚湾以外，红嘴奎利亚雀的地理分布与高粱的产区重合。每个国家的单宁高粱比例与红嘴奎利亚雀的分布面积呈显著正相关的模式。单宁高粱在东非和南非分布更多，同时鸟害更为严重；无单宁的高粱在西非分布更广，只有轻微的鸟害。

研究人员以Sh1 和Adh1（中性位点）作为参照，调查了Tan1 和Tan2 在三个高粱群体（10个野生种，17个单宁栽培种，39个无单宁栽培种）的核苷酸多样性（π）和固定系数（FST）。在Tan1 和Tan2 的基因附近，和变化与Sh1类似。HKA检验和表明Tan1 和Tan2 受中等程度的选择。

正如南非农民通过选育高杆水稻来抵抗定期洪水一样，单宁高粱的出现也是非洲某些地区需要的性状，用以保护植株抵抗鸟害。

图9 | 非洲不同国家红嘴奎利亚雀的分布区和单宁高粱的频率相关性

图10 | 野生种，地方种和栽培种中Tan1 和Tan2 的核苷酸多样性（π）和固定系数（FST）

人类TAS2Rs 突变和单宁高粱的平行地理分布

单宁能够抵挡红嘴奎利亚雀和其它害虫，却由于苦味，不能变成粮食。早期研究指出TAS2R 在非洲的分化与类似的苦味刺激物水扬苷有关。有能力分辨丙硫氧嘧啶试剂的试味者（下文简称Tasters）可以从单宁含量高的高粱籽粒中感知苦味，而不能分辨的人（non-Tasters）对于高粱并无偏好。同时，单宁合成的前体物质（表儿茶酸或者原花青素）已经在体外实验中证实能够激活人类的TAS2R4，TAS2R5和TAS2R39。同时TAS2R4 和TAS2R5 的单倍型区块变异者从咖啡中感知到的苦味，而祖先类型的单倍型（non-taster）感受的苦味更少。因此，TAS2R 的变异可能与单宁的分布有关。

研究人员比较了单宁的分布和公共数据库中已知的非洲人群的TAS2R 变异类型中。33个注释到的TAS2R 基因中，18个TAS2R 基因在高粱产区的2605个人中有56个SNP位点。两个TAS2Rs（TAS2R4 和TAS2R5 ）的三个SNP的分布与单宁高粱呈平行分布。三个SNP分别是rs2234002（错义突变，TAS2R4），rs2234012（TAS2R5 的5’UTR），rs2227264（错义突变，TAS2R5），三个突变处于高度连锁不平衡状态（r 2 = 0.858），组成了两个单倍型解释了受测人群中83.84%的变异。TAS2R4 和TAS2R5 的祖先等位在东非和南非中频率更高，而在西非人群中低，这与单宁高粱的分布一致。平行分布说明拥有TAS2R 祖先等位的non-taster为了避免产量的丢失，更倾向于种植单宁高粱，而轻微鸟害地区的taster为了更好的口感，更倾向于种植无单宁的高粱。

图11 | 人类TAS2R5 上突变分布，鸟害和单宁高粱频率的平行分布

文章亮点

1. 细致的表型考察，从田间调查的现象出发，从粗放的表型调查一步步锁定关键基因。将单宁含量这一代谢产物，通过颜色的深浅进行评分，用较低的成本精细定义表型。

2. 多个群体多处验证。从QTL定位到GWAS分析，从SNP分析到单倍型分析，从RIL群体到大规模panel，从高通量测序数据到单基因分型。

3. 大胆想象，从高粱到红嘴奎利亚雀的分布再到人类味觉受体基因的突变，通过三方面的证据，描述了高粱驯化过程，人类，环境和植物之间的协同进化关系，成为驯化三角（植物，环境，人类）的案例。

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