2个案例告诉你酵母双杂交低温胁迫那些事儿

前言

在植物研究领域，植物逆境研究一直都是热点，在人口众多，环境多样性复杂的地球生态中，获得有优良抗性的品种，对于农作物，经济作物，观赏植物都是极具科研和经济价值的。在这一领域，酵母双杂交技术因为其广谱适应性、实验操作易行、成本相对较低等特点，发挥了重要作用。小编会从低温胁迫，高温胁迫，盐胁迫，干旱胁迫，抗病虫害5个方面举例说明。今天先介绍低温胁迫，案例选自欧易生物客户2019年发表的文章。

案例 · 1

项目文章

An apple MYB transcription factor regulates cold tolerance and anthocyanin accumulation and undergoes MIEL1-mediated degradation--Plant Biotechnology Journal

研究内容

文章中发现MdMYB308L可以与MdbHLH33相互作用，同时可以增强MdbHLH33与MdCBF2 （耐寒相关基因）和 MdDFR（花青素合成相关基因）启动子的结合性，提高基因表达量，对苹果抗寒性和花青素积累具有正向调控作用。而MdMIEL1（MYB30-INTERACTING E3 LIGASE 1）可以与MdMYB308L互作，促进其泛素化降解，对苹果抗寒性有负调控作用。作者通过正负调控和正反验证实验，明确阐释了MdMYB308L在苹果抗寒反应中的作用机制。

A working model illustrating that MdMYB308L functions in cold stress response and anthocyanin accumulation.

研究思路和实验方法

阶段一通过转录组测序，找到了低温胁迫后差异表达基因MdMYB308L。然后在单基因功能层面，使用MdMYB308L过表达和抑制表达的转基因愈伤组织和模式植物拟南芥，从抗寒表型和花青素积累上进行了直接研究。（低温胁迫处理方法可见原文）

阶段二，从正调控上研究MdMYB308L是如何起作用的。有文献报道，MdbHLH33在苹果抗寒和花青素积累上也均起正调控作用，提出假想MdMYB308L是否是通过直接与MdbHLH33发生互作，发挥其生物学功能的？在证明两个蛋白是否互作上，首先就使用了酵母双杂交技术，验证结果为阳性。接着通过pull-down、BiFC进一步验证，结果阳性。

MdMYB308L与MdbHLH33在酵母细胞中互作实验结果

在MdMYB308L过表达和抑制表达转基因植株中，MdbHLH33表达量并无明显差异，而通过EMSA实验发现，MdMYB308L原来是通过促进MdbHLH33对下游基因的激活作用，实现抗寒和花青素积累功能的。而且，通过沉默MdbHLH33基因，在过表达MdMYB308L转基因植株抗寒表型和花青素含量上仍有一定增加，说明MdMYB308L的靶基因不止MdbHLH33一个。

阶段三，从负调控上研究MdMYB308L是如何起作用的。在该阶段，不得不说酵母双杂交实验发挥了至关重要的作用。作者将MdMYB308L作为诱饵，通过酵母双杂交实验筛选苹果文库，获得了阳性互作基因MdMIEL1。并通过一对一互作验证，进一步证明了这两个基因在酵母细胞中存在互作。

MdMYB308L与MdMIEL1在酵母细胞中互作实验结果

MdMIEL1编码RING E3泛素连接酶，有文献报道MdMIEL1在抗氧化、抗盐胁迫以及花青素积累上都起负调控作用。且证实MYB30，MYB98 和MYB1是MIEL1的泛素化底物。于是，作者又提出假想：MdMIEL1是否也对MdMYB308L进行了泛素化修饰，调控其蛋白降解呢。结果通过体内外泛素化模式实验证实了假想成立，同时对MdMIEL1过表达和抑制表达的转基因植株（母株为MdMYB308L过表达的苹果愈伤和拟南芥植株）的抗寒表型、花青素含量检测分析进一步证实了结论。

案例 · 2

项目文章

BRASSINOSTEROID-INSENSITIVE2 Negatively Regulates the Stability of Transcription Factor ICE1 in Response to Cold Stress in Arabidopsis--The Plant Cell

研究内容

为了研究BIN2（BRASSINOSTEROID-INSENSITIVE2）在植物应对低温胁迫反应过程中的作用机制，本文以酵母双杂交实验作为切入方法开展研究。具体为以BIN2为诱饵基因，将其构建于pGBKT7载体并转化进AH109酵母细胞中，筛选野生型拟南芥cDNA文库，获得了阳性互作基因ICE1。并进一步验证了ICE1截断体与BIN2的互作情况，在酵母细胞中证明是ICE1蛋白C端结构与BIN2存在相互作用。另外，BIN2的同源基因BIN2-LIKE1和BIL2在酵母细胞中也与ICE1互作，且通过pull-down和Co-IP实验进行了证实。

BIN2与ICE1及ICE1截断体在酵母细胞中互作实验结果

故事的开头讲完了但接下来的剧情是如何发展的呢？因为BIN2是一种蛋白激酶，所以作者提出假想，BIN2与ICE1互作，是否就是将ICE1磷酸化了呢？如果是，磷酸化后的ICE1会有什么功能性变化呢？

ICE1（INDUCER OF CBF EXPRESSION）从名字可看出，该蛋白是CBF蛋白表达的诱导物，也就是说ICE1作为转录因子可与CBF启动子结合，激活CBF的表达（文章中也通过EMSA实验进行了验证，CBF 是植物抗寒相关重要基因，在案例1中也有研究到其同源基因MdCBF2 ）。

我们都知道蛋白质磷酸化是调节和控制蛋白质活力和功能的最基本、最普遍，也是最重要的机制。蛋白质磷酸化主要发生在两种氨基酸上，一种是丝氨酸，另一种是酪氨酸。而作者也通过体内外磷酸化实验，证明了BIN2确实是与ICE1互作且使ICE1磷酸化了，其主要的磷酸化位点为ICE1S94A。以ICE1S94A突变体进行对比研究，发现在低温锻炼减弱期（复苏期）BIN2通过使ICE1磷酸化，促进其与E3泛素连接酶HOS1结合，加快ICE1的泛素化降解进程，导致CBF表达下调，实现植物在抗寒与生长之间的平衡（意思就是春天到了，冰雪消融，可以开始茁壮生长了）。而在低温锻炼初期，BIN2表达量是低水平的，ICE1含量较高，促使CBF高表达，增强植物抗寒能力（冬天来了，该冬眠了）。

图 | 该文阐释的抗寒胁迫中BIN2相关基因互作调控网络

Proposed Model of the Role of BIN2 in Modulating Cold-Stress Responses through Regulating ICE1 Stability in Arabidopsis.

看完以上2个案例，是否收获了酵母文库研究新思路？

转眼便是樱花季，往年此时早已万物复苏，欣欣向荣

2020已过1/4，欧易生物先后为科研工作者们送上了一波波福利，各位都有用准确姿势接收嘛？不管怎样，如果想做酵母双杂交，请随时来撩 ，我们初心不忘，一直都在！

END

本文系欧易生物原创

转载请注明本文转自欧易生物