项目文章 | 大鼠TBI模型分析m6A甲基化转录图谱

基本信息

论文题目：Epitranscriptomic profiling of N6-methyladenosine-related RNA methylation in rat cerebral cortex following traumatic brain injury

发表期刊：Molecular Brain

影响因子：4.051

作者单位：武汉大学中南医院

本文涉及的高通量技术：甲基化 RNA 免疫沉淀测序（Methylated (m6A) RNA Immunoprecipitation Sequencing，MeRIP-Seq/m6A-seq）由欧易生物提供

研究背景

创伤性脑损伤（TBI）会造成半数以上幸存者在受伤后一年内严重致残，部分会导致毁灭性的神经系统疾病，包括认知或记忆障碍，以及运动、感觉或情感功能障碍，轻度TBI也可能会发展成慢性创伤性脑病。

其致病机理主要包含原发性机械损害轴突和神经元的一部分，以及产生继发性损伤如迟发性细胞死亡（如铁死亡）、脑水肿、代谢缺陷，及创伤后生理生化变化而引起的血脑屏障损伤。

N6甲基腺苷（m6A）是真核生物mRNA最常见的转录后修饰。据报道，哺乳动物中枢神经系统中m6A对感觉体验、学习和损伤有刺激依赖性调节作用，但大鼠创伤性脑损伤（TBI）大脑皮层m6A甲基化的mRNA模式尚未被研究。

研究内容

与TBI中的DNA修饰相比，RNA甲基化的作用至今尚未阐明。为探讨TBI后RNA的表观遗传修饰及其在TBI后对神经再生的作用，作者构建了大鼠脑损伤TBI常用模型皮质损伤（CCI）模型，并分别分析脑皮质m6A甲基化图谱和转录图谱。大鼠CCI模型是一种广泛应用的TBI模型。通过对RNA和m6A甲基化水平的分析，作者发现了潜在的新靶点，为TBI的进一步干预提供了基础。

研究思路

研究结果

1. TBI后大鼠大脑皮层METTL14和FTO表达量分析

利用qRT-PCR对TBI和Shame组大鼠进行甲基化转移酶和去甲基化酶的6个基因METTL3、METTL14、WTAP、VIRMA、FTO和ALKBH5进行检测，结果发现METTL14和FTO发生明显下降。

图1 | RT-PCR检测 METTL3、METTL14、WTAP、VIRMA、FTO和ALKBH5的表达量

2. MeRIP-seq检测m6A甲基化分布

分别在MeRIP-seq样本和Input样本中获得平均11.67Gb和13.46Gb raw data及平均10.66Gb和12.28Gb的clean data。m6A甲基化位点最多的染色体分别是1号、3号和10号染色体，其甲基化位点分别为1386、921和905个（图2a）。分析m6A甲基化峰在mRNA基因结构中的分布规律，发现m6A甲基化峰主要分布在外显子区，在3′端（靠近终止密码子）有明显的富集峰，在5′端（靠近起始密码子）有明显的富集峰（图2b）。作者选择了三个基因来显示m6A甲基化分布模式。Trmt10c的峰值位于CDS区域，Coro7的峰值位于CDS和3'UTR区域，Plk的峰值位于3'UTR、CDS和5'UTR区域（图2c）。

图2 | m6A峰的拓扑分布

3. 大鼠TBI后差异m6A分析

TBI组和Shame组分别平均获得15,305peaks和16,714peaks（图3a）。与input样本相比，TBI组的平均对数倍丰度为4.11，sham组的平均对数倍丰度为3.72（图3b）；TBI组和Shame组分别平均peak长度为3426.14bp和3831.73bp（图3c）。

图3 | TBI后 m6A peak峰的数目、丰度和长度分布；对应图4应该是TBI后差异 m6A peak峰的数目、丰度和长度分布

TBI组和Shame组共鉴定出2165个显著变化的峰（p<0.01，FDR<0.05），其中1062个峰显著上调，1103个峰显著下调（图4a），4900个基因中有1580个具有差异甲基化的峰。所有峰的平均对数倍丰度为2.53（图4b），每个峰的平均长度为4358.7bp（图4c），p值在各峰之间的分布如图4d所示。

图4 | TBI和Shame组 m6A peak峰的数目、差异peak峰数目、和peak峰的长度分布

显著变化峰主要分布在CDS（49.95%）、内含子（22.86%）、3′UTR（19.82%）和5′UTR（7.34%）中，只有0.02%分布在基因间区（图5a）。许多差异显著峰跨越了多个基因结构，在CDS和3′UTR区有556个峰，CDS和内含子区有532个峰，CDS有495个峰（图5b）。图5c显示了三个具有显著变化峰的代表性基因，TBI后CD14、Dll4和Sox7的m6A水平分别显著上调3.63倍、2.10倍和3倍。

图5 | TBI后显著变化峰的分布

4. TBI后m6A甲基化基因功能分析

GO分析显示差异m6A甲基化基因与三种生物学信息相关。分子功能：蛋白质结合，Poly（A） RNA结合，染色质结合；细胞成分：核浆，细胞核，细胞质；生物学过程：轴突束化，小脑发育，子宫胚胎发育（图6a）。差异m6A甲基化基因主要参与KEGG中肾细胞癌、癌中的microRNAs和癌中的蛋白多糖等信号通路（图6b）。

图6 | m6A甲基化位点基因的GO和KEGG分析

5. 转录组测序分析TBI后大鼠大脑皮质基因表达水平

转录组测序结果表明，TBI后大鼠大脑皮层共有428个mRNA表达增加，280个mRNA表达减少（p<0.05，log2FC>1）（图7b），火山图中标记了5个最显著的上调基因（Il1r2、Fosl1、Ptx3、Hsbp8和Msn）和5个最显著的下调基因（Hdac9、Tril、Fam107a、Pcdh20和Prom1）。

图7 | TBI引起的mRNA的表达变化

6. m6A甲基化图谱和转录组图谱联合分析

选择log2foldchange＞0.5，p＜0.01的差异peaks与log2foldchange＞0.5，p＜0.05的差异mRNA进行联合分析，结果有175个mRNA和其m6A peaks发生明显改变，其中40个mRNA同时上调，41个mRNA同时下调。其关联分析结果参考图8a和图8b的象限图和韦恩图。随后，作者针对这175个基因进行了蛋白互作网图（图8c）的绘制。

图8 | TBI后m6A甲基化与mRNA表达的联合分析

7. FTO抑制剂FB23-2增加TBI后大鼠mNSS评分

为探讨m6A去甲基化酶FTO在TBI后大鼠神经功能控制中的作用，作者选择了TBI+FB23-2、TBI+DMSO、Sham+FB23-2和Sham+DMSO进行mNSS和MWM试验。结果发现，Sham组在连续4天使用和不使用FB23-2无明显差异，表明FB23-2对正常大鼠神经功能无影响。

另一方面所有TBI组（TBI+FB23-2和TBI+DMSO）mNSS评分均显著性高于Sham组（Sham+FB23-2和Sham+DMSO），表明CCI对神经功能造成了损害。FTO抑制剂加重了TBI对神经功能的损害程度，即随着时间增加TBI+FB23-2 组和TBI+DMSO组mNSS评分逐渐降低。然而，MWM实验结果显示，TBI+FB23-2a和TBI+DMSO组的空间学习记忆能力没有差异，说明FTO抑制剂对CCI大鼠的空间学习记忆没有影响（图8c）。

图9 | FTO抑制剂FB23-2对TBI患者神经功能、认知和学习能力的影响

参考文献

Yu J, Zhang Y, Ma H, et al. Epitranscriptomic profiling of N6-methyladenosine-related RNA methylation in rat cerebral cortex following traumatic brain injury. Mol Brain 2020; 13(1): 11