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实时定量PCR探针

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参考报价: 500-1700 RMB(人民币) 型号: 实时定量PCR探针
品牌: 赛百盛 产地: 北京
关注度: 17 信息完整度:
样本: 典型用户: 暂无
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实时定量PCR探针的合成
(Real-time PCR Probes)
 

 

名称2 OD5 OD10 ODTaqman probes with Black Hole Quencher 元/条元/条元/条5' -FAM and 3'- BHQ-16007009005'- HEX and 3'-BHQ-175090012005' -TET and 3' –BHQ-175090012005' -Cy3  and 3' –BHQ-21000130019005' -Cy5 and 3' –BHQ-31000130019005' -TAMRA and 3' –BHQ-26508001100Taqman probes with TAMRA Quencher元/条元/条元/条5' -FAM and 3' -TAMRA5006008005' -HEX and 3' -TAMRA65080011005' -TET and 3' -TAMRA6508001100Molecular Beacon元/条元/条元/条5' -FAM and 3' -Dabcyl5006008005' -HEX and 3' -Dabcyl65080011005' -TET and 3' -Dabcyl65080011005' -Cy3  and 3' -Dabcyl900120017005' -Cy5  and 3' -Dabcyl900120017005' -TAMRA and 3' -Dabcyl600700900

l  探针的长度在35个碱基以内,碱基合成不再另收费
l  PAGE 或HPLC 纯化
l  PAGE和荧光分光光度计质检
l  3-4个工作日出货
 
 
实时定量PCR (qPCR)的优势
·       实时检测PCR反应过程
·       精确计算出每个循环的PCR产物量
·       扩增和检测同时进行
·       消除后续PCR的干扰
在实时定量PCR反应中,杂交探针与插入染料如SYBR Green相比是更好的选择。荧光标记探针可以提高实时定量PCR结果的效率、灵敏度和特异性。而且定量PCR可以在一个反应里同时检测多个目标基因。
实时定量PCR的应用
·       基因表达分析
·       转基因检测和定量
·       病原体检测和定量
·       基因型/ SNP分析
·       突变检测
多重PCR分析的优点
·       省钱省时省力
·       所需样品量少
·       消除移液误差
·       可以在一个反应里设置内部对照
·       便于筛选
 
双标探针的原理
 

 
PCR 扩增时,在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针。该探针为一线性的寡核苷酸,两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团,探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收, PCR 仪检测不到荧光信号; PCR 扩增时(在延伸阶段), Taq 酶的 5' - 3' 外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条 DNA 链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步,这也是定量的基础所在。
 
 
荧光共振能量转移(FRET)技术的原理
 

 
 
两条线性寡核苷酸探针,其中一条的 3 ‘端标记荧光激发基团,另一条的 5 ' 端标记荧光检测基团,在无靶序列的情况下,两条探针分开,无法进行能量的传递,这样荧光仪不能检测到荧光信号;而当有靶序列时,即在 PCR 的退火阶段两条探针与靶序列结合,使得两条探针上的荧光基团可以进行能量的传递,这样荧光仪就可以检测到荧光信号,荧光信号的强弱代表了靶序列的多少。 
 
 
分子信标的原理
 

 
分子信标技术是在同一探针的两末端分别标记荧光基团和淬灭基团,为一种标记荧光的发夹探针。在未与模板发生杂交前该探针分子呈发夹结构,结合在其两端的荧光基团距离上接近,产生能量转移效应,不发生荧光。当该探针与模板杂交,使荧光基团与淬灭荧光基团彼此在空间上产生足够的分离,荧光基团脱离了淬灭基团的影响,从而产生可被检测到的荧光。荧光的强度与溶液中模板的量成正比,因此可用于PCR定量分析。
 
下表列出的是最常用的荧光基团及与之匹配的淬灭基团
 

Spectral Properties Table DyeColorMax.
EX (nm)Max.
EM (nm)Compatible
Quencher 6-FAMGreen492515BHQ-1, TAMRA JOEOrange520548BHQ-1, TAMRA TETOrange521536BHQ-1, TAMRA HEXPink535556BHQ-1, TAMRA TAMRARose556580BHQ-2 Cy3Red552570BHQ-2 ROXRed587607BHQ-2 Cy5Violet643667BHQ-3        

 

 
由于NED, VIC,PET等荧光素的专利归Perkin Elmer公司所有,所以我们推荐以下可替代的荧光素:
 

DyeExcitationEmissionVIC538554HEX535556NED553575TAMRA556580PET558595Redmond RED579595LIZ638655CY5646662Texas Red583603Cy3.5588604ROX586610Cy3.5588604



实验中常用的淬灭基团

 使用无荧光的淬灭基团可以提高实时定量PCR、多重PCR、FRET实验中的灵敏度。

 

Dabcyl – Dark Quencher 400–550 nm分子信标推荐使用Dabcyl淬灭基团。它在抑制蓝色至绿色发射光谱的各种荧光染料时非常有效,但是不适合淬灭发射光谱大于480nm的荧光素。
淬灭范围: 400-550 nm
最大吸光值:453 nm
摩尔消光系数:32.000 M−1 cm−1
分子量:399.2 g/molBHQ1 – Dark Quencher 480-580 nmBHQ1是Biosearch Technologies公司的黑洞淬灭基团之一,对于双标探针、分子信标和FRET探针非常有效,对绿色至黑色发射光谱中的所有染料都有极好的光谱重叠效应。
淬灭范围: 480-580 nm
最大吸光值: 534 nm
摩尔消光系数: 34.000 M−1 cm−1
分子量: 491.5 g/molBHQ2 – Dark Quencher 520-650 nmBHQ2 是Biosearch Technologies 公司的第二个黑洞淬灭基团。BHQ2能高效应用于5’端带荧光的双标探针、分子信标和FRET探针,有效发射光谱是由深绿色至橙色。
淬灭范围: 520-600 nm
最大吸光值:544 nm
摩尔消光系数 91.000 M−1 cm−1
分子量:493.5 g/molTAMRA – Fluorescent Quencher 520-600 nmTAMRA (Tetramethylrhodamin)是一种可以用作双标探针及分子信标的3’端和内部淬灭基团(TAMRA-dT)的荧光染料。它的淬灭范围适合5’端的报告基团,如FAM, HEX, TET, JOE, Yakima Yellow, Cy3 或者其他这个波长范围内的染料。在多重PCR中不推荐使用TAMRA,因为它的荧光特性将使淬灭基团和报告基团光谱发生重叠,增加背景干扰。
淬灭范围: 520-600 nm
最大吸光值: 544nm
摩尔消光系数: 91.000 M−1 cm−1
分子量: 612.7 g/mol

 
双标探针和5’核酸酶试验引物的设计准则
 
双标探针 (荧光淬灭探针或称FQ探针) 在其5’端和3’端分别有一个荧光报告和淬灭基团。利用Taq DNA聚合酶5’-3’的核酸外切酶活性,这些探针可以用于定量PCR体系。靶序列的特异性探针和特异性的PCR引物同时使用,设计的该探针在上下游PCR引物的范围内退火。在PCR的延伸阶段,Taq DNA聚合酶5’-3’的核酸外切酶活性将荧光报告基团从探针上切割下来。随着PCR循环数的增加,游离报告基团的数量不断的增加,实时检测从游离荧光基团上释放的荧光信号,从而对靶序列进行定量分析。
在设计这些双标探针的时候需要谨记以下几个要点。

探针的结合位置很重要,先设计好探针再设计PCR引物。

探针的结合位点应该靠近扩增产物的中心,扩增产物的长度应该在50-150bp之间。

探针的解链温度应该在68℃至70℃之间。

探针的长度最少20bp,否则容易发生非特异性结合。

尽量避免在探针的5’端出现dG ,因为dG 是一个较弱的淬灭剂,任何dG 都要离5’端至少两个碱基。

 

 
探针的设计标准:
G-C 含量::30~80%
多聚碱基::避免出现多个重复碱基,特别是4个或者多于4个G。
末端构成::在末端不能出现G。
退火温度::68-70℃
DNA链:挑选C多余G的链。如果使用互补链,确保C不存在于3’端。
长度::少于30个碱基。
设计:淬灭基团在3’端,荧光染料在5’端。
 
引物的设计标准:
G-C含量: 30-80%
多聚碱基: 避免出现多个重复碱基,特别是4个或者多于4个G
末端组成: 3’端的5个碱基中不能多于两个G或者C,建议A出现在3’端,便于引物二聚体更加高效的降解。
退火温度::58-60℃
产物: 50-150 个碱基
设计: 在设计完探针之后再设计引物,尽量紧靠探针但是不要发生重叠。其中的一条引物可以和外显子交接,用于扩增mRNA。
 
分子信标的设计原则:
 
分子信标的5’端和3’端也分别有一个荧光报告基团和一个淬灭基团。当荧光染料和淬灭基团接近的时候,探针会形成一个发夹结构。在PCR中,分子信标是特别针对目的基因设计的,分子信标探针可以使PCR引物退火。在PCR的退火阶段,探针和它对应的靶序列杂交,发夹环解开后,荧光报告基团和淬灭基团分离,可以发出一个荧光信号。信号的强弱和靶序列的多少成正比,通过实时监测这个信号,可以对靶序列进行定量。为了精确检测PCR过程,分子信标必须和它们的靶序列在退火阶段杂交成功,而游离的分子信标应该继续保持封闭状态,不会发出任何荧光。通过适当选择探针的长度和靶序列的长度,当温度高于退火温度7-10℃时,探针能够从靶序列上脱离下来,这样的探针序列的长度就很适宜。探针与靶序列的解链温度可以用“GC百分比”原则预测,很多设计探针的软件包都使用这个原则。在添加茎环区序列之前,这个预测方法只能用在探针序列的设计上。实际应用中,探针序列的长度范围通常是15-30个核苷酸。
 

上图显示的是分子信标在实时定量PCR中的应用原理
A: 不和靶序列结合的时候,分子信标呈现发夹结构。荧光报告基团和淬灭基团的紧密结合阻止了报告基团释放荧光。B: 在PCR的退火阶段,分子信标和靶序列杂交结合,将荧光染料和淬灭基团分离,导致荧光染料释放信号。信号的强弱和靶序列的多少成正比,实时监测荧光信号可以对靶序列进行定量。

茎环区的解链温度比退火温度高7~10℃

探针的环状区需要15~30碱基

茎环区的两边长度应该在5~7 碱基之间

扩增产物的长度少于150 bp

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