腺相关病毒包装

Oct-4 过表达2型重组腺相关病毒包装纯化实验

摘要：本实验使用 AAV-2无辅助病毒系统，获得高滴度的过表达human Oct-4基因的重组腺相关病毒颗粒，并使用qPCR方法测定病毒滴度。该病毒系统中外源基因的表达框为pAAV-CMV-Oct-4-IRES-ZsGreen-EGFP：CMV启动子驱动Oct-4基因的表达， 同时由IRES原件驱动ZsGreen基因的表达，可以用于观察重组腺相关病毒的工作状况。
关键词：AAV无辅助病毒系统，Oct-4，高滴度重组腺相关病毒包装，qPCR

一、 实验原理
腺相关病毒属微小病毒( parvovirus)家族的成员，为无包膜的单链线状DNA病毒。AAV的基因组约4700bp，包括上下游两个开放读码框架(ORF)，位于分别由145个核苷酸组成的2个反向末端重复序列(ITR)之间。重组腺相关病毒具有安全性高、免疫原性低、能介导基因在动物体内长期稳定表达，因而被认为是zei有潜力成为基因治疗工具的载体而在国内外研究中广泛应用。
包装重组腺相关病毒时有9中不同的AAV血清型可供客户选择，建议客户针对不同组织器官选择相应血清型的AAV病毒，见下表。 重组腺相关病毒可用于基因的过表达 （3kb以下）、shRNA（单条或者多条串联）、miRNA（pre-miRNA或者pri-miRNA）以及可诱导表达。

                                                                                              9种不同血清型对各组织器官细胞的亲和性

重组腺相关病毒包装技术服务包含内容：
1. 重组腺相关病毒载体的构建：将目的基因克隆构建到腺相关病毒载体，根据不同的研究需求，有用于基因过表达的重组腺相关病毒载体、     
用于RNAi的重组腺相关病毒载体等。
2. 重组腺相关病毒病毒包装：重组腺相关病毒载体与辅助载体（客户选定的不同血清型）一起转染AAV-293细胞进行包装，将包装好的病毒纯化和浓缩。
3. 重组腺相关病毒鉴定与质量控制：载体测序鉴定、QPCR测定滴度、感染活性测定。
zei常用的重组腺相关病毒载体：

                          重组腺相关病毒基因过表达载体

                             重组腺相关病毒基因干扰载体

二、 实验目的
使用AAV-2无辅助病毒包装系统获得高滴度的过表达human Oct-4基因的AAV-2病毒颗粒，用于研究Oct-4基因功能学研究。

三、 实验步骤
1. AAV血清型以及载体的选择及构建：
本实验选择AAV-2， 并采用pAAV-CMV-Oct-4-IRES-ZsGreen过表达载体，将human Oct-4基因构建到CMV启动子下游， 位于β-globlin 内含子与IRES元件之间。
                            

2. 病毒包装：
1) 复苏AAV-293细胞到15cm 培养皿中。24-72h后，当细胞达到70%汇合度的时候，1:3分盘。48h后，1:10分盘。48h后可以进行质粒转染。
2) 使用obio病毒包装转染试剂，按照使用说明，三种质粒（pHelper：pAAV-RC2：pAAV-CMV-Oct-4-IRES-ZsGreen=1：1：1）共转染AAV-293细胞。
3) 转染60h后，使用细胞刮将细胞刮下，并收集到离心管。
4) 1500g 4℃离心5min。将细胞沉淀重悬在7ml 的 10mM Tris-HCl 缓冲液中。
5) 细胞可-80℃保存直到进行纯化。

3. 病毒纯化：
1) 取细胞裂解液在干冰/乙醇浴-37℃水浴中反复冻融8次。
2) 使用10mM Tris-HCl¬将裂解液定容到21ml。
3) 使用Misonic Sonicator超声仪超声7min（输出2）。
4) 加入2ml DNase I（3mg/ml）37℃孵育30min。
5) 再次超声7min。
6) 加入2.5ml 10% 脱氧胆酸钠，2.1ml 0.25%胰酶-EDTA，混合均匀后37℃孵育30min，冰上放置20min。
7) 加入16.9g CsCl。混合均匀后，37℃孵育20min。中间摇动，直到CsCl完全溶解。
8) 4℃3000g离心30min，小心地将细胞裂解液转移到超速离心管（约5ml/tube）。
9) 4℃53,000rpm (266,400g)离心30h。
10) 使用自制的针头收集病毒层。
11) 4℃透析，12-16h换透析液，每次使用4L缓冲液。

4. 滴度检测：
1) 取2μl 纯化后的病毒液加入50μl PCR 碱性裂解液中，100℃，加热10min。放置冰上10min，加入50μl中和缓冲液。（同时准备质粒对照模板：106-1011拷贝/μl）。
2) 按照以下体系准备qPCR样品（20μl体系）：10μl SYBR green master mix， 0.3μl 正向引物，0.3μl 反向引物，1μl模板，8.4μl 水（RSV promoter：正向: GGTTGTACGCGGTTAGGAGT；反向：GGCATGTTGCTAACTCATCG）。
3) 分析滴度。

5. 病毒表达检测：
1) HEK-293细胞按照2×105/ml重悬后铺盘到12孔板中。
2) 24h后，选取两个孔进行细胞计算。
3) 按照5,000 GC/cell准备AAV病毒（对照病毒以及Oct-4-IRES-ZsGreen重组腺相关病毒）：细胞数目×5,000 GC/100μl培养基。
4) 吸取12孔板中上清，加入100μl培养基。放入培养箱中培养90min，中途轻微晃动。90min后每孔加入900μl培养基，继续培养48h。
5) 显微镜下观察，拍照。

四、 实验结果
                                                           计算显示Oct-4-IRES-ZsGreen重组腺相关病毒的滴度为6.1 X 1010 GC/ml (genome copies/ml).

                                                                                  
                                                      图1. 对照病毒（左）以及Oct-4-IRES-ZsGreen重组腺相关病毒（右） 感染HEK-293细胞（5,000 GC/cell）
qPCR结果显示，Oct-4-IRES-ZsGreen重组腺相关病毒的滴度达到6.1 X 1010 GC/ml (genome copies/ml) 。
在未添加腺病毒或其它促进表达的药物的情况下，5000GC/ml的Oct-4-IRES-ZsGreen重组腺相关病毒感染HEK-293细胞48h，感染效率可以达到80%以上。
 
五、 参考文献
1. Senapathy P, Carter BJ. Molecular cloning of adeno-associated virus variant genomes and generation of infectious virus by recombination in mammalian cells.J Biol Chem. 1984;7: 4661-4666.
2. Wang L, Blouin V, Brument N, Bello-Roufai M,et al.Production and purification of recombinant adeno-associated vectors.Methods Mol Biol. 2011;807:361-404

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