慢病毒包装

Oct-4过表达慢病毒包装纯化实验

摘要：本实验使用四质粒包装系统获得高滴度的过表达human Oct-4基因的慢病毒颗粒。病毒滴度的检测使用qPCR定量检测慢病毒在细胞基因组中的整合拷贝数，能够严谨客观地反应慢病毒的感染和整合能力。该慢病毒系统中外源基因的表达框为pLenti–CMV- Oct-4-EGFP-3FLAG-PGK-Puro：CMV启动子驱动Oct-4-EGFP基因的表达， 同时由PGK启动子驱动puromycin抗性基因的表达。其中EGFP可以用于观察慢病毒的工作状况，Puromycin抗性基因可以用于快速筛选稳定细胞株。
关键词：四质粒慢病毒包装系统，Oct-4-EGFP，高滴度慢病毒包装，慢病毒纯化，qPCR

一、 实验原理
慢病毒(Lentivirus) 载体是以HIV-1 (人类免疫缺陷Ⅰ型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。对于一些较难转染的细胞， 如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。
所以，在体外实验及体内实验的研究中，慢病毒己经成为表达外源基因或外源shRNA的常用载体形式之一， 并且正在获得越来越广泛的应用。

二、 实验目的
使用四质粒包装系统获得高滴度的过表达human Oct-4基因的慢病毒颗粒，用于研究Oct-4基因功能学研究。

三、 实验步骤
1. 载体选择及构建（构建方法详见第4页）：
                                          

                                                                                              pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro图谱：

2. 病毒包装：
包装细胞准备：
1) 细胞复苏：
a) 准备适当的灭菌培养瓶，标上细胞系名称、传代数和日期。
b) 液氮罐中取出冻存的细胞，并在密封容器中转移到实验室中。
c) 将细胞从容器中拿出到适当温度中的水浴箱中，用37℃水浴。只浸没冻存管的下半部分，解冻到冻存管中只剩少量固体，通常需要 
1-2min，迅速转移到生物安全柜中。
d) 用70%酒精棉擦拭冻存管的外部，并无菌打开冻存管。
e) 慢慢的用移液管逐滴移至37℃温育过的培养液中，用以稀释冻存液中的DMSO。
f) 在37℃，5%CO2中进行培养。
g) 24h后倒置显微镜观察细胞状态，如果有必要需进行传代。
2) 细胞传代：
a) 倒置显微镜观察细胞，评估细胞汇合的程度以及确认无细菌和真菌污染。
b) 移去培养瓶中的培养液。
c) 相当于培养液体积一半的PBS清洗单层细胞，一般三次即可。
d) 按1ml/25cm2表面积的量加入0.25%胰酶消化单层细胞。摇晃培养瓶使其胰蛋白酶覆盖细胞单层，倒出多余的胰蛋白酶。
e) 将培养瓶放回培养箱，放置2-10min。
f) 用倒置显微镜观察细胞以确保所有细胞都分离且漂浮，轻拍培养瓶的一侧来释放残留的贴壁细胞。
g) 用少量的含新鲜血清的培养液重悬细胞以灭活胰蛋白酶，取出100-200μl用于计数。
h) 将所需数量的细胞移至一个新标记好的含温育过培养液的培养瓶中或者培养板上；选择适当培养条件培养细胞系。
i) 按照细胞系的生长特性重复该步骤，直到细胞状态良好、无污染，可以铺板使用，其余选择冻存。
3) 活细胞计数：
a) 取一瓶传代的细胞，待长成单层以后使用；细胞悬液的制备方法：用0.25%的胰酶消化、PBS液洗涤后，加入培养液（或Hanks液或PBS等平衡盐溶液），吹打制成待测细胞悬液。
b) 盖好盖玻片，取一套血球计数槽，制备计数用的细胞悬液：用吸管吸适量细胞悬液到离心管中，加入等体积台盼蓝染液，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。若仅是单纯的进行细胞计数，不考虑细胞的活力，则可不使用台盼蓝染色。
c) 将细胞悬液滴入计数板，注意盖玻片下不要有气泡，也不要悬液流入旁边槽中。
d) 统计四个大格的细胞数，将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的大格（每格含有16个中格）中没有被染液染上色的细胞数目。
e) 计算原细胞悬液的细胞数。按照下面公式计算细胞密度：
（细胞悬液的细胞数）/ml=（四个大格子细胞数/4）×2×104
说明：公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。
公式中乘以2因为细胞悬液于染液1：1稀释。
1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）=0.1mm3；1ml=1000mm3
4) 细胞冻存：
用倒置显微镜观察细胞，评估细胞密度以及确认无细菌和真菌污染，移去培养瓶中的培养液，用相当于培养液体积一半的PBS清洗单层细胞，一般三次即可，按1ml/25cm2表面积的量加入0.25%胰酶消化单层细胞。摇晃培养瓶使胰蛋白酶覆盖细胞单层。倒出多余的胰蛋白酶，将培养瓶放回培养箱，放置2~10min，用倒置显微镜观察细胞以确保所有细胞都分离且漂浮，轻拍培养瓶的一侧来释放残留的贴壁细胞，用少量的含新鲜血清的培养液重悬细胞以灭活胰蛋白酶。取出100~200μl用于计数。为了冻存后有好的复苏效果，理想细胞的存活率应超过90%。将剩余的细胞150g离心5min，在冻存培养液中，以2~4×106个细胞/ml的密度重悬细胞，吸取1ml细胞悬液转移至标有细胞系名称、传代次数的冻存管中，将冻存管放置冻存盒中放入-80℃冰箱过夜，zei后将冷冻的冻存管转移到液氮的气相层内存放，并记录位置。

包装过程：
1) 转染前一天，将细胞接种到100mm dish中，控制细胞转染时的密度为70-80%。
2) 转染前一小时取出细胞培养板，去除原有细胞培养基，加入10ml的Opti-MEM培养基，将细胞放回培养箱。
3) 制备转染试剂和质粒的复合物：
 将待转染的病毒载体质粒32μg（骨架质粒：穿梭质粒=1:1）溶于Opti-MEM培养基，总体积为500μl，轻轻混匀，静置5min。
 将Obio转染试剂溶于Opti-MEM培养基，总体积为500μl，轻轻混匀，静置5min。
 将Obio转染试剂稀释液滴加到质粒稀释液中，边加边轻轻混匀后在室温放置20min，使DNA和Obio转染试剂充分结合形成稳定的转染复合体。
 取出细胞培养板，将上面配好的DNA- Obio转染试剂复合体加入到细胞培养板中，做好标记，放回培养箱。
 6h后吸去培养基，PBS洗一次，加入10ml新鲜完全培养基培养。
关于病毒转染试剂及转染信息，请登陆网站：http://www.oobio.com.cn/。
包装荧光拍照质控结果：

收毒：
1) 转染48h后，第一次收毒，收集培养基至50ml离心管中，做上标记，并给细胞更换新鲜的完全培养基。
2) 转染72h后，第二次收毒，收集培养基至50ml离心管中，做上标记，丢弃细胞。
注：废弃的含病毒的培养基加入84消毒液（1:20左右），浸泡一天后丢弃。接触过病毒的枪头，离心管，培养板等其他物品可用84消毒液稀释液处理，也可以用煮沸处理半小时或高压湿热灭菌（121℃，30min）处理。

3. 慢病毒纯化：
1) 普通离心机：3500rpm，10min，RT离心后，上清马上倒入新的50ml离心管，0.45μm，过滤上清到超速离心管中。上清分装到12支超速离心管，两两对应配平衡，不够的体积可用不含血清的培养基配平。
2) 超速离心机：HITACHI，30,000rpm，2h，4℃，离心后，可观察到管壁一侧有白色的病毒沉淀，做上记号。在安全柜中，打开离心管，小心地弃上清，离心管倒扣在灭菌过的吸水纸上，弃未去除干净的上清。每管根据沉淀量添加DPBS，80μl-120μl/管，用封口膜封住管口，4℃溶解沉淀过夜。
3) 将同一种病毒，逐管收集法收集病毒到zei后一管，再用100μl DPBS收集2次，全部收到1.5ml 离心管中，按要求分装病毒，标记（病毒名称，年-月-日）-80℃冰箱保存。

4. 慢病毒滴度检测（Real time 定量PCR 法测定滴度）：
1) 样品制备：
a) 消化293T细胞，按1×105细胞每孔接种24孔板。
b) 细胞贴壁后（铺板后4~6h）加入病毒。
c) 12~20h后换液，去掉含病毒的培养基。
d) 感染后72h拍照记录荧光，收集细胞抽取基因组DNA并做定量PCR实验测定滴度。
2) Real-time PCR 检测：
Real-time PCR 在ABI7500 上完成。SYBR Master Mixture 来自TAKARA。
a) 下列比例配置反应体系：
                                                        

b) 设定程序为两步法Real-Time 定量。预变性95℃，15s，之后每一步变性95℃，5s，退火延伸60℃，34s，共进行40 个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。
Cycle 1: (1X)
Step 1: 95.0 ℃ for 00:15.
Cycle 2: (40X)
Step 1: 95.0 ℃ for 00:05.
Step 2: 60.0 ℃ for 00:34.
Data collection and real-time analysis enabled.
c) 制作熔解曲线。PCR 结束后， 在95℃变性1min。然后冷却至55℃，使DNA 双链充分结合。从55℃开始到95℃，每一步增加0.5℃，保持30s， 同时读取吸光值。
Cycle 3: (1X)
Step 1: 95.0 ℃ for 01:00.
Cycle 4: (1X)
Step 1: 55.0 ℃ for 01:00.
Cycle 5: (81X)
Step 1: 55.0 ℃-95.0 ℃ for 00:30.
Increase set point temperature after cycle 2 by 0.5 ℃

3) 滴度报告：
                                               

5. 慢病毒表达检测：
慢病毒感染工具细胞-293T，WB检测病毒表达情况（24孔板为例）：
第一天：细胞准备：
将长势良好的293T细胞接种到24孔板，消化好细胞后把细胞浓度调为1×105个/ml，按500μl/孔加入。接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同，一般是保证第二天进行病毒感染时细胞汇合率介于30-50%之间。
第二天：病毒感染：
感染实验分两组，按MOI 10、20加入病毒数 。加入感染增强剂，终浓度为5μg/ml。
第三天：换液：
感染8-12h后，弃去上清，换新鲜的完全培养基，500μl/孔。
(注：某些特殊细胞可以更换一半病毒液后，过夜，具体请咨询公司技术支持信箱：techservice@oobio.com.cn
第五天：观察荧光表达情况，收集蛋白样品，进行WB实验。
四、 参考文献
1. Dull T, Zufferey R, Kelly M, Mandel RJ, Nguyen M, Trono D, Naldini L.A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.J Virol. 1998 Nov;72(11):8463-71.
2. Naldini L, Blömer U, Gallay P, Ory D, Mulligan R, Gage FH, Verma IM, Trono D.In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.Science. 1996 Apr 12;272(5259):263-7.
3. Zennou V, Petit C, Guetard D, Nerhbass U, Montagnier L, Charneau P.HIV-1 genome nuclear import is mediated by a central DNA flap.Cell. 2000 Apr 14;101(2):173-85.
4. Zufferey R, Dull T, Mandel RJ, Bukovsky A, Quiroz D, Naldini L, Trono D.Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery.J Virol. 1998 Dec;72(12):9873-80.
5. Zufferey R, Donello JE, Trono D, Hope TJ.Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element enhances expression of transgenes delivered by retroviral vectors.J Virol. 1999 Apr;73(4):2886-92.

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