您好,欢迎您查看分析测试百科网,请问有什么帮助您的?

稍后再说 立即咨询
咨询列表
和元生物技术(上海)股份有限公司
X
头像

客服中心

如果企业客服不在线,也可拨打400电话联系。或者发布求购信息

400-6699-1171000
发布求购 平台客服
扫码下载
"来会会"App
扫码关注
分析测试百科网

和元生物技术(上海)股份有限公司

400-6699-1171000

分析测试百科网 认证会员,请放心拨打!

热门搜索:
分析测试百科网 > 和元生物 > 其它细胞生物学服务 > Pulldown

Pulldown

非会员

诚信认证:

工商注册信息已核实!

扫一扫即可访问手机版展台
参考报价: 面议 型号: 暂无
品牌: 暂无 产地: 暂无
关注度: 28 信息完整度:
样本: 典型用户: 暂无
咨询留言 在线咨询

400-6699-1171000

GST Pull-down实验

摘要:体外利用GST-PES1六种突变体蛋白(1-588aa全长,1-415aa, 322-455aa缺失,322-588aa,220-588aa,101-588aa)与His-NPM1的pull-down实验,确定PES1的220-322aa区域是与NPM1相互作用的结构域。为进一步研究PES1的功能提供实验数据。
关键词:PES1,NPM1,Pull-down, 蛋白相互作用,原核表达

 

一、 实验原理
利用重组技术将PES1蛋白与GST (Glutathione S transferase) 融合表达,融合蛋白通过GST与琼脂糖微球上结合的GTH (Glutathione)亲和结合。因此,如果PES1与NPM1之间有直接相互作用,当结合了PES1蛋白的GTH微球的与含有NPM1蛋白的细胞裂解液混合孵育,再通过离心富集GST微球,得到的样品中可以检测到NPM1。

 

二、 实验目的
在体外检测 NPM1 (nucleophosmin )与PES1(pescadillo)之间的直接相互作用,确定PES1与NPM1相互作用的结构域。

 

三、 实验步骤
1. 6×His-NPM1(pET-28a)质粒转化BL21-DE3感受态细胞:
2. 培养诱导蛋白表达 :
1) 挑取6×His-NPM1单克隆菌落到5ml培养基(含amp抗生素)。
2) 摇床37℃培养12-15h。按照1:100比例接种到50ml的培养基(含amp抗生素)。
3) 37℃培养到OD600吸光光度值0.6-0.8(大概2.5-3h)。
4) 加入100mM IPTG至终浓度1.0mM诱导表达。
5) 低温(30℃)继续诱导培养2-4h。
6) 转移菌液到离心管,7700 g离心10min。弃去上清,在冰上控干。
7) 沉淀重悬在2.5ml PBS中。取10μl留用SDS-PAGE分析。
3. 裂解细胞:
1) 加入25 μl lysozyme(10 mg/ml in ddH2O)。利用干冰或者液氮冻融三次。 适宜条件下超声使菌液变得澄清。
2) 12,000g 4℃离心15min,上清转移到新的离心管。
4. 准备glutathione sepharose 4B beads,结合GST融合蛋白:
1) 将sepharose 4B摇动后使其重悬。
2) 取 500μl sepharose 4B beads,使用10ml PBS彻底清洗3次以去除乙醇。
3) 500g离心5min去除上清。
4) 使用500μl PBS重悬Sepharose 4B beads。
5) 每样品取20μl Sepharose 4B beads, 加入1ml binding buffer,再加入5μg纯化的GST对照蛋白,1-588aa全长GST-PES1
蛋白,1-415aa, 322-455aa缺失,322-588aa,220-588aa,101-588aa。
6) 室温混合孵育1h。
5. Pull-down 实验:
1) 每样品中加入His-NMP1诱导表达裂解液100μl。
2) 4℃混合过夜。
3) 500g离心5分种弃去上清。
4) 使用lysis buffer洗涤3-4 次。
5) 加入2x SDS上样液,煮样品10min。
6. Western Blot分析结果:
使用anti-his标签抗体检测 。

 


四、 实验结果

                                                                        图1. GST-PES1各种突变体示意图

 

                                                                                                                                                                                                


                                                                              图2. GST Pull-down结果

                                                    
从图2的结果可以看到,PES1的220-322aa之间的结构域是与NPM1相互作用必须的。

 

五、 参考文献
1. Zhang J, Yang Y, Wu J. B23 interacts with PES1 and is involved in nucleolar localization of PES1. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 2009; 12: 991-997.

 

 

Pulldown信息由和元生物技术(上海)股份有限公司为您提供,如您想了解更多关于Pulldown报价、型号、参数等信息,欢迎来电或留言咨询。

注:该产品未在中华人民共和国食品药品监督管理部门申请医疗器械注册和备案,不可用于临床诊断或治疗等相关用途

Pulldown - 产品推荐

移动版: 资讯 直播 仪器谱

Copyright ©2007-2023 ANTPEDIA, All Rights Reserved

京ICP备07018254号 京公网安备1101085018 电信与信息服务业务经营许可证:京ICP证110310号