RNA干扰服务

 天津赛尔生物的siRNA干扰服务由参与主编《RNA干扰：原理与应用》的工作人员，可以根据客户的需求，提供从siRNA设计到合成，shRNA质粒的构建，转染，病毒包装siRNA，RT-PCR及WB验证的一站式服务，让RNA干扰不再干扰您的科研。

一、技术背景：
    RNA干扰（RNA interfering，RNAi）现象是由与靶基因序列同源的双链RNA引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。由于RNAi具有高度的序列专一性和有效的干扰，可以特异地将特定的基因沉默，从而获得基因功能丧失或基因表达量的降低，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。RNAi技术可广泛应用到包括功能学，药物靶点筛选，细胞信号传导通路分析，疾病治疗等等。

 

二、实验流程：   
1：目的基因的分析及siRNA的设计。
2：基于化学合成的双链siRNA，基于载体的shRNA构建，病毒系统包括慢病毒( lentiviral ) 、逆转录病毒( retroviral ) 和腺病毒 ( adenoviral ) 包装siRNA。

2：体外通过转染或感染的方式导入siRNA。

3：RT-PCR，WB检测干扰效果。

三、交付内容：
1：siRNA序列。
2：采用质粒转染方式的，交付构建好的shRNA质粒。采用病毒系统包装siRNA的，交付含有包装shRNA序列的重组病毒。
3：RT-PCR，WB检测结果。赛尔承诺，对于一些非公开siRNA序列基因的siRNA设计的干扰效果，三条序列中至少有一条干扰效果在75%以上。 
4：详尽的操作步骤及实验结果。

常见问题及解答
问1：怎样设计siRNA序列？
答：siRNA序列的设计一般遵照以下的步骤和原则 
1． 在所选基因的启动子后 50-100个碱基自5’-端开始 
2． 寻找基因序列中的23个碱基， 最好是5‘- AA（N19）TT -3’ （N是任何碱基） 
3． 如果找不到四个以上AA（N19）TT，则用 AA（N21）补足。 
4． 如果找不到四个以上AA（N21）， 则用 NA（N21）补足。 
5． 所选定序列中，G和C的数目的总和在总数（23）的35-55%. 
6． 满足以上1-5项要求的片段数目如果不足四个，将G和C的数目的总和放宽至总数（23）的30-70%. 
7． 选好上述序列后，以此确定所需合成双链RNA oligo 的序列如下： 
8． 正义序列 （N19）TT 与上述选定的23 个碱基序列中的第3-23个碱基相同 
9． 反义序列的3’----5’ 的序列与目标序列中的第1-21个碱基互补， 即A变成T，C变成G， T变成A， G变成C。 
10． 将反义序列3’----5’ 改写成 5’----3’. 
11． 将最后所得序列中除3’- 末端的两个碱基之外的所有碱基中的T都用U来替代。 最后每三个组成一个字节，中间断开。
12． 将所选定的正义序列和反义序列与gene bank 中已知同物种的基因序列进行比较，确定其惟一性（BLAST） 13． 上述 7-10 项可见如下例子： 
假如通过1-5 项的条件选出的一段23 个碱基的序列是 
5’- AAGCTAGTCATGGCCATTGACTT - 3’ 
正义序列就应该是： 5’- GCTAGTCATGGCCATTGACTT - 3’ 
反义序列就应该是: 3’- TTCGATCAGTACCGGTAACTG -5’ 
反转处理后即得： 
正义序列： 5’- GCTAGTCATGGCCATTGACTT - 3’ 
反义序列： 5’- GTCAATGGCCATGACTAGCTT -3’ 
U替代T以后得到： 
正义序列： 5’- GCUAGUCAUGGCCAUUGACTT - 3’ 
反义序列： 5’- GUCAAUGGCCAUGACUAGCTT -3’ 
段开字节后最后得到： 
正义序列： 5’- GCU AGU CAU GGC CAU UGA CTT - 3’ 
反义序列： 5’- GUC AAU GGC CAU GAC UAG CTT -3’ 
赛尔的siRNA专家曾经参与编写《RNA干扰：原理与应用》，在siRNA设计方面非常有经验，成功的为客户设计了数百条siRNA序列。 　

问2：化学合成siRNA,编码shRNA载体构建生产siRNA，重组病毒导入siRNA, 我该采用哪种方法进行RNA干扰？
答：化学合成siRNA：操作简便，研究人员得到合成好的siRNA后，进行简单的稀释处理即可实验，但是基因抑制持续时间短，对细胞毒性较大。 
编码shRNA载体构建生产siRNA：与化学合成siRNA相比：shRNA载体能够更有效阻遏相应基因的表达，可以用于稳定细胞系的建立，可以持续提供siRNA，携带GFP的载体可以用于检测转染效率。操作相对复杂，需要构建shRNA质粒。 
重组病毒包装siRNA: 实验操作相对复杂，对技术要求较高，费用较高，特别适合于一些难转染的细胞系（如原代细胞，干细胞）的siRNA干扰。 
所以客户要综合本实验的要求，成本等各个方面选择适合自己实验的RNA干扰方法。 　 

问3：为什么我采用国外文献已经公布并且确定的siRNA序列，通过脂质体转染的方法在我的细胞系中没有得到预期的干扰效果？
答：国外文献已经公布并且确定的siRNA序列从序列本身来说应该没有问题，可能的情况是您的细胞系是否适用于常规的转染方法，对于转染效率低于50%的细胞系，我们建议采用重组病毒包装siRNA的方法。所以您首先要通过查阅文献或做一个GFP的对照实验检测一下您细胞的转染效率。 

问4：在转染过程中发现细胞死亡，应该怎么处理？
答：常规的脂质体转染试剂都会对细胞有一定的毒性，这不用奇怪。按照我们的经验，如果细胞的死亡在30%以下，应该算是正常的。如果细胞的死亡大于60%，在排除其他操作的情况下，您就需要对转染条件进行优化，优化的过程一般包括以下几个方面：
1.调整转染试剂的浓度； 
2.在转染后适当的时间内更换无转染试剂的培养液， 
3.调整细胞的生长状态；一般处于良好生长状态的细胞对转染试剂就有更好的耐受性； 
4.调整转染试剂和siRNA的比例
 

 

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