英拜生物 siRNA载体构建服务程序：

1. siRNA表达载体的选用：
本公司选用的siRNA表达载体含新霉素抗性基因和GFP绿色萤光标记，可以建立稳定表达系，同时可以实时监测载体在细胞中的转染效率。载体中还含有Amp 抗性基因，可以无限扩增。

2. 设计siRNA 靶序列
A、根据目的mRNA序列，设计3 条RNA干扰靶序列，靶序列一般为19－21nt长。
B、对于每条选定的siRNA靶序列，设计siRNA正义链和反义链，以loop(9nt)相连，称为shRNA（short hairpin RNA）。

3. 合成模板：
合成每条编码shRNA的DNA 模板的两条单链，退火DNA 单链得到shRNA的DNA双链模板。模板链后面接有RNA PolyIII聚合酶转录中止位点， 同时两端分别设计BamHI和HindIII酶切位点， 可以克隆到siRNA载体多克隆位点的BamHI 和 HindIII酶切位点之间。

4. siRNA空载体用BamHI 和 HindIII双酶切后，1％琼脂糖凝胶电泳，回收线性载体。

5. 连接与转化：
把退火的DNA 模板双链连接到线性载体中。采用T4连接酶，插入片断与载体的摩尔比约为3：1。连接产物转化DH5α 大肠杆菌，在LB Amp培养基上涂板，37℃培养过夜。

6. PCR鉴定：
挑取转化的菌落PCR，2％琼脂糖凝胶电泳鉴定具有shRNA编码序列的阳性克隆（图例）。

7.测序鉴定：
对PCR鉴定阳性的克隆再进行测序鉴定，确定shRNA编码框架和模板序列正确无误(图例)。

8. 柱抽提阳性克隆载体并定量。

siRNA 序列的siRNA™试剂盒包括：
√ 3条编码shRNA的载体（各10µg）,保证其中一条siRNA 序列的有效.
√ 1条编码阴性对照shRNA的载体（10µg）
采用的阴性对照是通用序列，在人和小鼠的基因组中都没有同源位点；
√ 大肠杆菌DH5α菌株
√ siRNA载体的构建、鉴定记录及使用说明。

载体的构建技术服务信息由上海英拜生物科技有限公司为您提供，如您想了解更多关于载体的构建技术服务报价、型号、参数等信息，欢迎来电或留言咨询。

注：该产品未在中华人民共和国食品药品监督管理部门申请医疗器械注册和备案，不可用于临床诊断或治疗等相关用途