piRNA测序（piRNA-seq）

 piRNA测序

piRNA是一类长度为26～31nt单链的小RNA，大部分集中在29～30nt。piRNA的表达具有组织特异性，只存在于具有全能性的动物细胞，如生殖细胞、肿瘤细胞和干细胞等。piRNA通过与Piwi亚家族蛋白结合形成piRNA复合物（piRC）来发挥生物学功能（沉默转录基因过程，维持生殖系和干细胞功能，调节翻译和mRNA的稳定性）。此外，piRNA在一些癌症细胞中存在异常表达的现象，提示piRNA可能参与癌症的发生，并可作为癌症诊断和治疗中的潜在生物标记物。

PiRNA 的沉默机制主要利用（1）通过转录自与转座元件（TE）加工而成piRNA，并结合互补结合TE 抑制其转录；（2） 通过编码蛋白基因区转录加工成piRNA, 与AGO3，AUB 蛋白形成复合体抑制靶基因；（3）由基因3'UTR 转录生成piRNA，并结合与PIWI,抑制靶基因； （4）从piRNA 簇生成piRNA，并与AUB 等蛋白相互作用起到抑制靶基因的目的。（5）另外，piRNA 也被报道有起到高甲基化调控的协同调控行为。piRNA 的生成加工过程途径（Biogenesis Pathway）主要分为二大类：（a）转录自TE 转录元件或piRNA 簇的反义链经过加工，加载到蛋白AUB 或PIWI 上形成功能piRNA。通常piRNA 介导的piRISC 复合体起到引发第二种生成加工途径的激发作用。（b）通过AUB 和AGO3 蛋白的剪接体翠功能发生piRNA 扩增效应（即Ping?pong 循环反应）。(参见下图)

PiRNA测序实验流程：

piRNA分析内容包括：

piRNA 的预测识别：通过高通量small RNA 测序数据预测piRNA;

piRNA 全基因组分布特征分析：解析piRNA 在全基因组范围内的具体定位和簇分布特征

piRNA 临近序列特征提取：采用motif 短序列模式比配算法识别piRNA 临近调控区域加工区域特征，5'U 端和10nt 位置权重矩阵分析等计算调控序列的非随机性概率，预测其序列调控功能。

全基因组TE 转座子元件预测与重新注释：针对物种基因组内的转座子序列，将转座子识别

为若干类别，包括long terminal repeat (LTR),  long interspersed nuclear (LINE),  and inverted 

repeat (IR)  elements。 并结合piRNA的生成来源进行座位的富集度分析和聚类；

全基因组特征区域的覆盖度分析：针对rRNA,tRNA,miRNA,coding gene,repeat,transposon, Su(Ste),  AT?ChX 等特殊基因组功能区域进行序列的覆盖度分析;

piRNA 全基因组ORF 与CDS 注释：结合piRNA 定位进行功能基因的分布分析；

piRNA 表达量计算与piRNA 簇表达相关性分析：计算样本之间的piRNA 表达量，计算样本之间piRNA 簇之间的表达相关系数。

统计重复序列内piRNA表达量分布，基因区piRNA表达量分布。

图例：piRNA基因组定位分析

图例：piRNA在重复区内的表达量分布统计以及核酸偏好性分析

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