DNA甲基化检测--焦磷酸测序（Pyrophosphate sequencing）

焦***酸测序实验

1、焦***酸测序技术原理

焦***酸测序技术是由 4 种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。焦***酸测

序技术的原理是：引物与模板 DNA 退火后，在 DNA 聚合酶(DNA polymerase)、ATP 硫酸

化酶(ATP sulfurytase).荧光素酶(1uciferase)和三***酸腺苷双***酸酶(Apyrase)4 种酶的协同

作用下，将引物上每一个 dNTP 的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的

释放和强度，达到实时测定 DNA 序列的目的。焦***酸测序技术的反应体系由反应底物、待

测单链、测序引物和 4 种酶构成。反应底物为 5’-***酰硫酸(adenosine- 5’-phosphosulfat，

APS)、荧光素(1uciferin)。

2、焦***酸测序技术的反应过程

在每一轮测序反应中，反应体系中只加入一种脱氧核苷酸三***酸(dNTP)。如果它刚好

能和 DNA 模板的下一个碱基配对，则会在 DNA 聚合酶的作用下，添加到测序引物的 3’末端，同时释放出一个分子的焦***酸(PPi)。在 ATP 硫酸化酶的作用下，生成的 PPi 可以和

APS 结合形成 ATP,在荧光素酶的催化下，生成的 ATP 又可以和荧光素结合形成氧化荧光

素，同时产生可见光。通过微弱光检测装置及处理软件可获得一个特异的检测峰，峰值的高

低则和相匹配的碱基数成正比。如果加入的 dNTP 不能和 DNA 模板的下一个碱基配对，则

上述反应不会发生，也就没有检测峰。反应体系中剩余的 dNTP 和残留的少量 ATP 在

Apyrase 的作用下发生降解。待上一轮反应完成后，加入另一种 dNTP，使上述反应重复进

行，根据获得的峰值图即可读取准确的 DNA 序列信息。
3、焦***酸测序检测DNA甲基化
    CpG甲基化焦***酸测序检测法基于引物延伸的Pyrosequencing技术，通过将链合成过程中释放出的焦***酸(PPi)转化成光信号来监测链的合成过程。通过检测CpG对应位点上C/T渗入的比例对目标位点的甲基化程度进行定量分析方法。

操作流程：
a、DNA亚硫酸盐处理
b、用焦***酸测序专门引物设计软件设计甲基化引物
c、进行PCR扩增预实验及正式实验
d、PCR产物上焦***酸测序仪检测
 实验实例：

服服务说明
 ①样品要求：
a、血液样品：样品为EDTA抗凝或枸椽酸钠抗凝，样品量大于0.5 ml，样品采集后于-20℃或-80℃保存，低温（≤-4℃）运输。
b、组织样品：样品可以为新鲜组织（zei好-80℃保存）或石蜡包埋的组织，也可以是95%乙醇中固定的组织，组织量大于100 mg。
c、DNA样品：纯度OD260/280 比值为1.8-1.9，浓度≥50ng/ul，体积≥50ul。
②提供详细的基因信息
  焦***酸测序待测序列≤60bp，且上下游保留200bp用于引物设计；

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