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原位杂交

参考报价: 面议 型号: 原位杂交
品牌: 基尔顿 产地: 上海
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AI问答
可以做哪些实验,检测什么? 可以用哪些耗材和试剂?

 

◆ 概述
    原位杂交组织(或细胞)化学 (In situ Hybridization Histochemistry, ISHH) 简称原位杂交(In Situ Hybridization),属于固相分子杂交的范畴,它是用标记的DNA或RNA为探针,在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。根据所用探针和靶核酸的不同,原位杂交可分为DNA-DNA杂交,DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交三类。

    根据探针的标记物是否直接被检测,原位杂交又可分为直接法和间接法两类。直接法主要用放射性同位素、荧光及某些酶标记的探针与靶核酸进行杂交,杂交后分别通过放射自显影、荧光显微镜术或成色酶促反应直接显示。间接法一般用半抗原标记探针,最后通过免疫组织化学法对半抗原定位,间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。

    原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其他成分的影响,因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便;同时由于原位杂交不需要从组织中提取核酸,对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性,并可完整地保持组织与细胞的形态,更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。


◆ 操作流程
    原位杂交反应(以DIG-cDNA探针为例):
    取材
    ● 0.1M PBS (pH 7.2) 浸 5-10min。
    ● 0.1M甘氨酸/0.1M PBS 浸5min。
    ● 0.3%TritonX-100/0.1M PBS 浸10-15min。
    ● 0.1M PBS 洗 5min×3次,加蛋白酶K(1μg/ml),37℃孵育30 min。
    ● 4%多聚甲醛浸5min。
    ● 0.1M PBS 洗 5min×2次,浸入新鲜配制的含0.25%乙酸酐/0.1M三乙醇胺中10min。
    ● 预杂交:滴加适量预杂交液,42℃ 30 min。
    ● 杂交:倾去预杂交液,在每张切片上滴加10-20μl杂交液(将探针变性后稀释在预杂交液中,0.5 ng/μl ),覆以盖玻片或蜡膜,42℃ 过夜。(阴性对照)
    ● 洗片:(1) 4×SSC、2×SSC、1×SSC、0.5×SSC 37℃各洗20min;0.2×SSC 37℃洗10min;0.2×SSC与0.1M PBS各半洗10min;0.05M PBS 洗 5min×2次。
    ● 3% BSA/0.05M PBS 包被,37℃ 30min.
    ● 滴加抗digaoxin-抗血清碱性***酸酶复合物(以抗体稀释液1:5000稀释)4℃孵育过夜。
    ● 0.05M PBS洗15min×4次; TSM1 10min×2次; 新鲜配制TSM2 10min×2次。
    ● 显色:在玻片上滴加适量显色液,4℃避光过夜。
    ● 将玻片置于TE中10-30min以终止反应。
    ● 酒精梯度脱水、二甲苯脱脂。
    ● 中性树胶封片,显微镜下观察结果。


原位杂交

原位杂交(in situ hybridization)将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交,称为原位杂交。用原位杂交技术,可在原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。此方法有很高的敏感性和特异性,可进一步从分子水平来探讨细胞的功能表达及其调节机制。已成为当今细胞生物学、分子生物学研究的重要手段。


原位杂交

实验步骤:前期胚胎的制备。

原位杂交第1天进行重新水化和固定、预杂交、杂交。

原位杂交第二天进行 

1 将探针回收,放于-20C保存(通常探针可重复使用十次左右)

2加入50%甲酰胺/2XSSCT溶液1毫升,60℃,放置30分钟,重复一次。

3置换2XSSCT1ml,60℃,放置15分钟。

4置换0.2XSSCT1ml,60℃,放置30分钟,重复一次。

5用MABT洗两次,每次五分钟,放在摇床轻轻摇动。

6室温下加1ml 1:2:7溶液,时间为一小时。  

7  按1:3000的比例在1:2:7溶液中加入酶连地高辛抗体,4C 冰箱过夜。


原位杂交第三天进行

1) 用1ml含10%热灭活血清的MABT溶液置换抗体溶液,放置摇床上25分钟,然后用1mlMABT置换,25分钟,再用1mlMABT溶液置换,一小时以上,后用1mlMABT溶液置换,25分钟。

2) 用1ml 1mM米睉的Staining buffer洗三次,每次放置五分钟。

3)将胚胎转入十六孔板中,吸去staining buffer,加上300ul BM Purple AP Substrate(底物,用之前加5mM米唑),十六孔板外面包上锡箔纸以避光,避免摇动,室温下显色。

4)每隔一小时观察胚胎是否开始显色

5)将显色的胚胎中的底物吸出,用PBST洗两三次后加上4%多聚甲醛固定,拍照。6)4C冰箱保存。


原位杂交服务内容:①细胞特异性mRNA转录的定位,可用于基因图谱,基因表达和基因组进化的研究;

                   ②感染组织中病毒DNA/RNA的检测和定位,如EB病毒mRNA、巨细胞病毒DNA的检测;

                   ③癌基因、抑癌基因及各种功能基因在转录水平的表达及其变化的检测;

                   ④基因在染色体上的定位;

                   ⑤检测染色体的变化,如染色体数量异常和染色体易位等;

                   ⑥分裂间期细胞遗传学的研究,如遗传病的产前诊断和某些遗传病基因携带者的确定,某些肿瘤的诊断和生物学剂量测定等。


原位杂交信息由基尔顿生物科技(上海)有限公司为您提供,如您想了解更多关于原位杂交报价、型号、参数等信息,欢迎来电或留言咨询。

注:该产品未在中华人民共和国食品药品监督管理部门申请医疗器械注册和备案,不可用于临床诊断或治疗等相关用途

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