肿瘤外泌体研究方案

基于临床样本，分析验证临床样本外泌体中显著影响肿瘤转移的miRNA，探讨其致病的分子机制，为后续抗肿瘤外泌体药物的靶点以及生物标记物的确定提供前期数据基础。

技术原理

外泌体（exosomes）是一种直径大约为50-150nm，具有脂质双层膜结构的微小囊泡，外泌体可由大部分细胞分泌，进入各种体液内。外泌体中携带着多种蛋白、肽段、脂质和核酸（例如microRNAs、mRNAs和长链非编码RNA），可作为细胞-细胞间的中介传递重要信号，影响细胞的生理及病理状态。随着对外泌体的研究越来越多，越来越深入，研究者发现它广泛参与了机体免疫应答、抗原呈递、细胞分化、肿瘤生长与侵袭等各种生物过程中。尤其在肿瘤发生发展过程中，由肿瘤细胞或肿瘤微环境中的基质细胞分泌的外泌体作为这种细胞间通讯的重要介质，在癌细胞的持续生长、侵袭和转移中起到重要作用。通过对临床样本分析（如转移和非转移患者血液样本），分离鉴定样本中的外泌体，将外泌体与肿瘤细胞或者血管内皮细胞进行共孵育，检测肿瘤细胞转移能力或者血管内皮细胞成管能力的变化。同时通过表达谱芯片分析不同样本外泌体中的差异miRNA，通过高通量细胞功能学筛选平台HCS筛选验证其中的关键功能miRNA。对外泌体供体肿瘤细胞进行关键功能miRNA调控，将分离出的外泌体处理受体细胞（肿瘤细胞或血管内皮细胞），检测外泌体miRNA的转运、功能以及作用分子机制，同时在动物水平验证该关键miRNA的体内功能。

结果展示

1. 根据感兴趣的临床问题（比如：肿瘤转移组与非转移组等），收集血清血浆样本，通过差速高速离心法和膜过滤法从血清血浆中抽提外泌体，并进行WB、TEM电镜鉴定、NTA粒径分析。

示例图1：

2. 外泌体功能、内容物分子分析

    2.1. 外泌体功能分析：根据临床问题以及参考文献，选择相应的细胞模型以及功能试验进行验证分析，根据以下2个实验方向的结果选择其中一个方向进行后续实验：

    2.1.1. 取实验1中临床样本中的外泌体，处理肿瘤细胞系，通过Transwell转移实验验证外泌体对肿瘤细胞转移功能的影响；

    2.1.2. 取实验1中临床样本中的外泌体，处理血管内皮细胞HMEC1，通过血管形成实验验证外泌体对血管内皮细胞的血管形成能力的影响；

    2.2. 外泌体内容物分子分析

取实验1中的外泌体，抽提RNA，进行miRNA芯片，分析样本间的差异miRNA，并对miRNA进行生信分析。

示例图2：

3. 高内涵细胞功能学筛选关键miRNA 以及功能验证

    3.1. 利用高内涵细胞功能学研究平台（HCS）筛选外泌体差异miRNA中的关键功能miRNA。从2.2实验结果中筛选疾病组中高表达且未在相关疾病中报道过的20个miRNA，合成miRNA mimics，分别转染一株受体细胞，每个mimic三复孔，通过相关功能检测筛选得到显著影响细胞功能的基因。

（受体细胞为肿瘤细胞系，进行Transwell转移（转移样本）HCS筛选；受体细胞为血管内皮细胞，进行血管形成HCS筛选）

    3.2. 对筛选到的miRNA做进一步功能验证：肿瘤细胞系进一步补充Transwell（+ECM）侵袭实验、划痕愈合、EMT marker（6个）WB检测；血管内皮细胞进一步补充血管通透性实验、Transwell转移实验、划痕愈合，MTT，Edu等实验。分组：NC， mimics

4. 外泌体运输miRNA作用研究

    4.1. 在肿瘤细胞系（两株）中转染目的miRNA mimics，取细胞培液上清孵育受体细胞，qPCR检测受体细胞内目的miRNA表达量以及功能变化（实验同3.1和3.2）。分组：NC-CM，mimics-CM

    4.2. 在肿瘤细胞系（两株）中转染目的miRNA mimics，抽提细胞培养上清中外泌体，对外泌体进行PKH26染色标记，与受体细胞共孵育，检测受体细胞对外泌体的内吞，qPCR检测外泌体中miRNA的量以及受体细胞内目的miRNA的表达量和功能变化（实验同3.1和3.2）。分组：NC-exo，mimics-exo

示例图3：

5. 目的miRNA In vivo功能验证。

运用裸鼠尾静脉注射成瘤模型验证目的miRNA在体内的功能。构建miRNA过表达慢病毒以及NC慢病毒，感染肿瘤细胞系后，注射裸鼠尾静脉，每组各10只，每周进行一次活体成像检测转移情况，检测到转移成功，处死小鼠，取器官进行成像，比较NC和OE两组。

示例图4：

6. 目的miRNA作用机制研究

    6.1. miRNA靶基因预测，通过Targetscan，microRNA.ORG、miRDBA和miRanda四个数据库对miRNA进行靶基因预测，取四个数据库交集靶基因，进行GO、KEGG分析KEGG pathway分析。

    6.2. 选取靶基因中与功能相关若干基因，在受体细胞中转染目的miRNA mimics，qPCR验证若干靶基因的表达。获得阳性靶基因之后，进一步进行WB验证。分组：NC，mimics

    6.3. 在肿瘤细胞系（两株）中转染目的miRNA mimics，抽提细胞培养上清中外泌体，孵育受体细胞，检测受体细胞内靶基因表达变化。分组：NC-exo，mimics-exo

    6.4. 运用荧光素酶报告基因实验验证目的miRNA与靶基因的互作，构建携带靶基因3’UTR序列以及突变序列的Luciferase报告基因载体与对照载体，与miRNA mimics共转染细胞，检测Luciferase荧光。分组：NC+nc-mimics，NC+miRNA-mimics，miRNA-mimics+靶基因-wt-3’UTR-LUC，miRNA-mimics+靶基因-mu-3’UTR-LUC,nc-mimics+靶基因-wt-3’UTR-LUC，nc-mimics+靶基因-mu-3’UTR-LUC

    6.5. 靶基因功能验证，在受体细胞上，干扰靶基因，验证细胞功能变化（实验同3.1和3.2）。分组：NC, KD

    6.6. 目的miRNA与靶基因功能相关性验证，在受体细胞中转染miRNA mimic，同时过表达靶基因，检测细胞内靶基因表达变化以及功能变化。分组：NC+nc-mimics，NC+miRNA-mimics，miRNA-mimics+靶基因-OE

研究技术路线

参考文献

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