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RNA干扰整体实验服务(RNAi基因干扰、SiRNA实验)案例介绍

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 RNA干扰(RNAi基因干扰、SiRNA实验):RNA干扰(RNA interfering,RNAi)现象是指由与靶基因序列同源的双链RNA(DsRNA)引发的基因转录后的沉默过程,小干扰RNA特异性介导相同序列的mRNA降解,阻断相应基因表达。嘉美生物提供的RAN干扰技术包括化学合成小RNA片段(SiRNA)和构建载体RNA(SnRNA)两种形式。实验委托者只需提供干预基因名称或基因序列ID,嘉美生物免费设计合适的干预位点,保证至少有一对小RNA有效抑制目的基因表达,抑制效率不低于70%。


RNA干扰(SiRNA实验)流程
第一步
  确定干扰基因,设计并合成合适的小干扰RNA(片段型或载体型小干扰RNA)。
第二步  预转染实验,进行细胞培养,摸索转染条件、时间并进行必要的检测(WB、PCR等),确定干预效果zei佳的一对小RNA。
第三步  正式实验,设置合理实验分组,进行瞬时或稳定转染。
第四步  转染后检测,根据实验要求选择细胞生物学检测、蛋白检测、分子生物学检测等。以研究小干扰RNA对于细胞、蛋白或基因功能的影响。


RNA干扰(SiRNA实验)检测(可根据委托者实验需求选择做)
1. 细胞检测:细胞增殖毒性MTT、细胞凋亡、细胞周期、细胞迁移、细胞侵袭;
2. 蛋白检测:免疫印迹WB、免疫细胞化学ICC、免疫荧光IF、流式细胞术FCM、酶联免疫ELSIA;
3. 分子生物检测:RT-PCR、实时荧光定量PCR、甲基化特异性PCR(MSP);
4. 其他检测:生化检测、酶类检测、脂类检测、糖类检测。


实验咨询:service@jiamay.com


实验案例: YYYY细胞在XXXX基因干扰后的增殖及侵袭能力实验


第一部分:实验细胞筛选

一、免疫荧光实验

实验试剂 :PBS(***酸盐缓冲液pH7.4),非免疫山羊血清,Triton X-100,BSA抗体稀释液,XXXX蛋白一抗 (1:100),二抗Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG (H+L) *2 mg/mL*(A21428)
免疫荧光(IF)染色:倒出细胞培养液,PBS冲洗三次;2-4%甲醛固定15分钟;1×PBS缓冲液(0.01 M,pH7.4)洗涤3次,每次5分钟;滴加非免疫山羊血清(内含0.3%Triton X-100)封闭液,覆盖液面2-3mm,室温放置60min,甩去多余液体;滴加一抗plscr1 50μL(1:100),4℃过夜;PBS洗3次,每次5分钟;滴加荧光标记的上述二抗50μL(1:200),室温 60分钟;PBS洗3次各5min;荧光显微镜下观察、拍照,每指标照相2套图像。
IF染色结果(400倍):通过荧光染色可以分析出,XXXX蛋白在YYYY细胞中表达量zei突出。
YYYY细胞 

 热点实验服务:RNA干扰整体实验服务(RNAi基因干扰、SiRNA实验)    热点实验服务:RNA干扰整体实验服务(RNAi基因干扰、SiRNA实验)
AAAA细胞   

热点实验服务:RNA干扰整体实验服务(RNAi基因干扰、SiRNA实验)    热点实验服务:RNA干扰整体实验服务(RNAi基因干扰、SiRNA实验)  
BBBB细胞 

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CCCC细胞

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二、RT-PCR实验

实验材料:细胞样品4份,分组编号(见图片标示)
试剂:Trizol Reagent,Invitrogen  Cat.NO.15596-026;ReverTra Ace-α-TM  First Strand cDNA Synthesis Kit ,TOYOBO #FSK-100;PCR Master Mix(2x) Fermentas # K0172;DNA Marker DL2,000, TaKaRa D501A;0.1% DEPC水、氯仿(分析纯)、异丙醇(分析纯)75%乙醇;AGAROSE(琼脂糖)  AMRESCO,K499;10×DNA上样缓冲液, 美国ProMab,SJ-R2008523;0.5mg/ml EB 溶液,实验室常备;1×TBE, 实验室常备,配方参照《分子克隆实验指南 第二版》
仪器:PCR仪,ABI9600;电泳仪,北京六一仪器公司,DYCP-31DN型;高速离心机,湘仪H1650-W; 紫外分光光度计,上海江仪仪器有限公司,UV-7502C(751);成像系统,柯达紫外显相系统 400W像素
引物资料:

Homo- XXXX-F    5- cacccatgtctaccaaagtt -3,Homo- XXXX-R    5- ctctcaaaattccagtccag -3,片段长度: 175bp
Homo-GAPDH-F   5-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3,Homo-GAPDH-R   5-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3,片段长度   450bp
实验步骤:
1、RNA提取:
每样本加入1ml Trizol试剂消化(组织约50mg—100mg充分剪碎,细胞约106—107);匀浆样品在室温静置5~10min后加入0.2倍体积的氯仿,震荡15秒后在2~8℃下12,000×g离心15min;将水样层转移至干净的试管,加入0.5倍体积的异丙醇,混匀后-20℃下静置10-15min,在2~8℃下12,000×g离心10min;移去上层悬液,将RNA沉淀用1ml 75%乙醇洗涤,在震荡器上混匀后2~8℃下7,500×g离心5min,弃去上清液;适度干燥RNA沉淀后,加入适量0.1% DEPC水,使RNA完全溶解;2000rpm离心20sec
2、总 RNA 定量:紫外分光光度计开机预热30 min;用蒸馏水洗涤石英比色皿,吸水纸吸干,加入DEPC水后,放入样品室的S池架上,关上盖板;设定紫外光波长(260nm、280nm)后校零(每次检测前均需调零);将待测样品适当稀释(RNA 1μl用DEPC水稀释至250μl)后,记录编号和稀释度;把装有稀释后待测样品的比色皿放进样品室的S架上,关闭盖板;分别测定260nm和280nm波长时的OD值(吸光度在0.1—0.5范围为zei佳);用蒸馏水洗涤石英比色皿,酒精浸泡。
3、实验结果判断:纯DNA:OD260/OD280≈1.8(>1.9,表明有RNA污染;<1.6,表明有蛋白质、酚等污染) 纯RNA:OD260/OD280≈2.0(<1.7时表明有蛋白质或酚污染;>2.0时表明可能有异硫***酸残存)

 

样本编号

稀释倍数

A260

A280

A260/A280

RNA浓度(ug/ul)

YYYY

250

0.348

0.179

1.944

3.48

AAAA

250

0.289

0.151

1.914

2.89

BBBB

250

0.302

0.159

1.899

3.02

CCCC

250

0.333

0.171

1.947

3.33

 

计算A260/ A280比值,比值≥1.8,满足实验要求。         
RT-PCR实验步骤:
产物用琼脂糖凝胶电泳检测:扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳,加样量为10μl(DNA样本8μl+上样缓冲液2μl) ,电压120V ,电泳完毕后在溴化乙锭( EB)中染色约15分钟,清水漂洗后凝胶成像系统拍照。
凝胶图片与平均光密度值:阳性条带以Gel pro4.0 版凝胶光密度分析软件进行分析,测其IOD值。

热点实验服务:RNA干扰整体实验服务(RNAi基因干扰、SiRNA实验)

点样说明及IOD参考值分析:

 

泳道

1

2

3

4

样品

YYYY

AAAA

BBBB

CCCC

XXXX基因

15930

8099

10591

12963

R

0.603

0.325

0.438

0.545

泳道

5

6

7

8

样品

YYYY

AAAA

BBBB

CCCC

GAPDH

26431

24934注:该产品未在中华人民共和国食品药品监督管理部门申请医疗器械注册和备案,不可用于临床诊断或治疗等相关用途

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