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明胶酶谱MMP活性检测实验服务案例介绍

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 大鼠心脏组织明胶酶谱MMP活性检测实验

 

实验仪器  泳电源Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell,Mini Teans-Blot Module,and PowerPac Basic Power Supply (BIO-RAD,Catalog#165-3323);电泳仪及附件Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell (BIO-RAD,Catalog#165-3301)

 

实验标本  大鼠心脏组织20个

 

实验试剂

 

1、凝胶试剂:30%丙烯酰胺溶液;Tris-Base(SIGMA);10%SDS(SIGMA);10%过硫酸铵;TEMED(sigma)
2、常用溶液及缓冲液:制备含MMP底物蛋白SDS-PAGE凝胶:采用8%分离胶。将20Xsubstrater融化,并90℃加热5分钟。分别在浓缩胶和分离胶中加入20Xsubstrate并使之稀释20倍,混匀,然后再加入过硫酸铵和TEMED,等待凝胶聚合。
A.5%积层胶所用溶液
按总体积2.5ml:
ddH2O:                               1.575ml
30%丙烯酰胺溶液:                      0.42ml
1.0mol/L Tris (PH=6.8):              0.315ml
10%SDS:                              25ul
20Xsubstrate:                        125ul
10%过硫酸铵:                          25ul
TEMED:                               3ul
B.8%分离胶溶液
按总体积10ml:
ddH2O:                               4.1ml
30%丙烯酰胺溶液:                      2.7ml
1.0mol/L Tris (PH=8.8):              2.5ml
10%SDS:                              100ul
20Xsubstrate:                        500ul
10%过硫酸铵:                          100ul
TEMED:                                6ul
C.电泳缓冲液,1L
3g Tris-Base、14.4g 甘氨酸、1g SDS,加蒸馏水至IL,pH应该在8.3左右。也可以制成10×的储存液,在室温下长期保存。

 

检测步骤

 

A、 阳性对照及待检测样品的前处理及上样 阳性对照:取5ul positive mixture与2XSDS-PAGE non-reducing buffer 等体积混合。待测样品5ul则1:1稀释于2XSDS-PAGE non-reducing buffer,混合后直接上样。不加热变性,并且仅使用不加还原剂的上样缓冲液。每孔点样10ul。
B、电泳 30mA恒流电泳45min,溴酚蓝跑出凝胶前沿时结束电泳。
C、洗涤凝胶 驱除凝胶,去除压缩胶。放入容器中,先用适量蒸馏水冲洗凝胶。然后加入10ml 1Xbuffer A,室温漂洗凝胶2X15分钟。中间换液2次。
D、孵育 倒掉Buffer A。加入10ml 1Xbuffer B,室温孵育4小时。
E、显色 倒掉Buffer。加入SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液水平摇床上染色120min后,再采用脱色液(甲醇浓度为25% ,乙酸浓度为10 %)进行脱色60min。
F、条带扫描 将凝胶放在扫描仪上扫描。用非透射光扫描,显示调整为灰度。并分析IOD值。72 kDa为MMP-2,92 kDa为MMP-9。
试剂盒组成与储存

1. 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml µl, −20 ℃
2. MMP-2 and MMP-9 positive mixture 500 µl, −20℃
3. 10 × Substrate G, 50 ml, −20℃ 
4. 10 × Buffer A, 50 ml, 4℃
5. 10 × Buffer B, 50 ml, 4℃
6. 10 × Mem-Gel Stain, 50 ml, 4℃

 

实验结果

注:阳性条带以Gel pro4.0 版凝胶光密度分析软件进行分析,测其IOD(integrated optical density)累积光密度参考值。(例如:1.33E+05=1.33×105)。   P: positive mixture   每孔点样蛋白约10ug

热点实验服务:明胶酶谱MMP活性检测案例

 

Lanes:

Lane1

Lane2

Lane3

Lane4

Lane5

Lane6

Lane7

Lane8

Lane9

LaneP

Rows

(IOD)

(IOD)

(IOD)

(IOD)

(IOD)

(IOD)

(IOD)

(IOD)

(IOD)

(IOD)

MMP-9

16200

20200

26700

33200

30474

43300

38600

35131

23500

60323

MMP-2

12535

101884

12974

12322.6

12170.2

11685

12481

9677.5

12522

16578

样本

1

2

3

4

5

6

7

8

9

P

 

热点实验服务:明胶酶谱MMP活性检测实验服务案例

 

Lanes:

Lane 1

Lane 2

Lane 3

Lane 4

Lane 5

Lane 6

Lane 7

Lane 8

Lane 9

Lane P

Rows

(IOD)

(IOD)

(IOD)

(IOD)

(IOD)

(IOD)

(IOD)

(IOD)

(IOD)

(IOD)

MMP-9

25390

25500

44900

42000

60300

43400

43100

36600

33400

67703

MMP-2

注:该产品未在中华人民共和国食品药品监督管理部门申请医疗器械注册和备案,不可用于临床诊断或治疗等相关用途

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