Illumina Solexa测序原理

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     Illumina Solexa测序原理

1.       文库制备

将基因组DNA打断成几百个碱基（或更短）的小片段，并在两个末端加上接头（adapter）

2.       桥式PCR产生DNA簇

IIIumina高通量测序芯片表面连接有一层单链引物，两端连接测序接头的单链DNA片段通过与芯片表面的引物碱基互补结合，引物扩增成为双链后，使双链变性成为单链，该单链DNA的一端就被“固定”在芯片上，而单链DNA的另一端随机和附近的另外一个引物互补，也被“固定”住，行成“桥（bridge）”。经过反复30轮扩增后，每个单分子得到了约1000倍扩增，成为单克隆“DNA簇”。

3.       利用可逆化学阻断技术测序

利用边合成边测序（Sequencing by synthesis）的原理，加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP。这些核苷酸是“可逆终止子”，其3’羟基末端带有可化学切割的部分，每个循环只容许掺入单个碱基。去除其他多余的dNTP后，用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应聚合上去的核苷酸种类。随后将这种基团化学切割，恢复3’端粘性，继续聚合第二个核苷酸。如此循环，直到每条模板序列都完全被聚合为双链。统计每轮收集到的荧光信号，就可得知每个模板DNA片段的序列。

4.       数据分析

自动读取碱基，数据被转移到自动分析通道进行二次分析。

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