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Small RNA测序及分析
MicroRNA(miRNA)是一类内生的、长度约20-24个核苷酸的小RNA,是发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成。目前研究microRNA的方法主要是通过实时定量PCR以及基因芯片技术,这些方法主要关注microRNA 的表达与定量,并仅局限于研究那些序列信息或二级茎环结构信息已知的microRNA,无法寻找和发现新的microRNA 分子。基于Illumina高通量测序平台的microRNA 测序技术突破了目前研究技术手段上的局限性,使研究人员能够直接对样本中指定大小的所有microRNA分子进行高通量测序,在无需任何序列信息的前提下研究microRNA的表达谱并在此基础上发现和鉴定新的microRNA分子,并提供了更加灵活和深入的研究分析方法。
一、技术路线
二、数据分析
1. 序列去杂(去除接头序列、简单序列等)
2. Rfam数据库以及Genbank数据库比对,去除rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA的降解片段
3. 鉴定mRNA的降解片段
4. 同miRNA数据库比对,鉴定miRNA
5. 同参考基因组比对,预测新的miRNA
6. 分析两个样品miRNA的表达差异
7. miRNA表达模式聚类分析
8. 预测miRNA靶基因
三、实验周期
由于合作伙伴的个性化需求不同,实验的周期也各不相同。从获得合作伙伴样品、高通量测序到数据分析,一般控制在30到40工作日内完成。
四、常见问题解答
1. 进行小RNA测序对于组织样品提取总RNA有什么特殊要求?
答:如果要进行小RNA测序,提取总RNA时建议不要使用Qiagen等公司的过柱试剂盒,也不要使用LiCl沉淀,以免损失小片段RNA。除此之外也可以使用专用小RNA提取试剂盒来进行提取。
2.Small RNA分析需要合作伙伴提供参考序列吗?
答:需要,zei好提供合作伙伴所做物种的全基因组序列,如果没有,也可以提供近缘物种的全基因组序列或者是本物种的EST等序列作为参考序列,另外还需要老师提供相关的exon/ intron, repeat信息以及基因编码序列。
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