lncRNA研究策略之RNA Pull-down实验问答

长链非编码RNA(longnoncodingRNA，lncRNA)是一类不编码蛋白的RNA分子，长度在200bp以上；研究表明，lncRNA具有保守的二级结构，可以与蛋白、DNA和RNA相互作用，参与多种生物学过程的调控。随着高通量测序技术的发展，越来越多的lncRNA被注释，但是绝大多数的lncRNA的功能仍然不清楚，因此lncRNA的研究是一片非常广阔的未知领域，具有极大的科研价值和意义。其中RNAPull-down技术为lncRNA生物学功能的验证起到了至关重要的作用。

RNAPull-down结合了体外转录与生物素标记、质谱技术，是研究非编码RNA与蛋白质相互作用的一大利器。由于实验程序较多、RNA的易降解性，加上一些不可预知的变量，因此实验存在一些难度，常常导致实验的失败。对于试验中常常出现的棘手的问题，金开瑞经过实践，总结了一套行之有效的应对方策，现在就和我们一起来看看吧！

1、RNAPull-down拉下蛋白PAGE电泳银染条带颜色浅且模糊？

①选取的组织或细胞样品其中互作蛋白表达量很低；

②体外转录得到的RNA降解或者不是全长；

③Pull-down实验孵育时间不长。

④其他

2、PAGE电泳银染背景深？

①样品杂蛋白太多；

②银染显色时间过长。

④其他

3、RNAPull-down拉下蛋白银染后看不到互作蛋白：

①选取的RNA序列不对；

②样品中没有表达互作的蛋白质。

③互作蛋白浓度低，银染图肉眼观察不到差异条带。

④其他

更多建议：

①lncRNA序列前期验证要完善；

②选择相应蛋白质表达量较高的组织或细胞样品；

③体外转录选择转录质量高的试剂盒，操作过程避免Rnase的污染；

④保证RNAPull-down实验中探针标记以及探针与蛋白的结合充分进行（依据体外转录RNA的量，样品裂解液蛋白浓度）；

⑤尽可能多将洗脱的蛋白电泳（同时可以避免显色时间过长）

好啦，这次就和大家分享这么多啦，如果您在RNAPull-down实验中遇到困惑，可以随时与我们取得联系哦，我们将及时帮您解决！

最后，祝大家实验顺利！生活愉快！