microRNA是一类大小为21-23nt的非编码小RNA分子，其通过与mRNA相互作用影响目标mRNA的稳定性及翻译，最终诱导基因沉默，调控基因表达，细胞生长，发育等生物过程。

基于第二代测序技术的microRNA测序，可以快速鉴定出已知的microRNA，也可以预测出新的可能microRNA，并分析其差异，为研究microRNA对细胞进程的作用及其生物学影响提供了有力工具。

一、数据分析流程

二、数据分析内容

1. microRNA长度分布统计以验证试验可靠性
应用fastx(fastx_toolkit-0.0.13.2)对测序原始reads进行预处理，去除接头序列以及低质量序列。

图为经过长度统计，各长度上序列的分布情况

2. 比对注释

将测序得到的序列与miRBBase以及其他非编码数据库ncRNA，pirna，Rfam数据库里的序列进行比对，对已知microRNA进行注释：
下图为经过注释的结果，其中分别列出和miRBase数据库，pirna数据库，Rfam数据库以及ncRNA数据库的比对情况。

下图为针对miRBase种Sus scrofa物种进行的比对注释统计：

由之前所得的注释结果，可以作图来更进一步展示其结果：

对整体的注释结果，还可以采取进一步的分析，例如：

（1） 统计碱基偏好性，下图就是测序所得序列分别在21,22,23,24长度上的5’碱基分布情况。

（2） 对于测序所得序列，可以统计出其正负链分布情况，以找寻生物学上的特征。

针对某单一microRNA，也可以对其进行更深度的分析。

例如，对其序列的匹配情况进行分别统计：

还可以对其对应的microRNA前体二级结构进行观察。

3. 分类注释

将测序得到的序列与物种所对应的基因组数据库比对，对有注释的reads的来源进行分类统计，鉴定并统计出已知的microRNA以及各种不同种类的RNA分子。
如图，经过与数据库进行分别比对，可以鉴定并统计出包括tRNA，rRNA,snoRNA,snRNA的数量及分布。

4. 差异分析

我们采取用DEGseq R语言包结合perl脚本将样品按照客户的分组情况，进行表达量的比较分析。
在差异分析中，我们会采用TPM（Transcripts per million,公式为：单一miRNA reads数×106/总reads数）作为标准化数据。

结果展示如下：

5. 饱和度分析

将注释结果按比例划分作图，以观察样品注释的趋势，发现其在生物学上的合理性。

6. 新microRNA预测

对于未注释上的序列，我们将其与该物种全基因组序列进行比对分析，通过折叠模型预测新的microRNA，通过折叠模型分析，若有序列位于茎环结构上，则初步判定该序列为一个候选的新microRNA。

对于预测出的新microRNA，我们会统计并列出其所位于的染色体，起始位置，终止位置，正负链，以及数目，长度，GC含量，最小自由能等数值。

对于新microRNA，我们还会计算并绘制出其前体的二级结构，以及其与成熟microRNA之间的位置关系。

7. mircoRNA作用靶基因预测：

采用miranda软件，对microRNA序列以及对应物种的基因组cDNA序列进行可能的靶位点预测Miranda软件比对结果示意图如下：

8． GO功能显著性富集分析（靶基因）


9． Pathway显著性富集分析（靶基因）

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