2016年miRNA删除功能研究解决方案

2016年miRNA删除功能研究课题思路（伯豪思路，引领科研）

CRISPR/Cas9靶向基因改造（敲除、敲入）技术是最新发展起来的一种强有力的用于基因组编辑（genome editing）的分子生物学工具，现已广泛应用于人、短尾猴、大鼠、小鼠、斑马鱼、果蝇、家蚕、线虫、酵母、拟南芥、烟草、高粱、水稻和小麦等各类动植物个体或细胞基因组的遗传学改造。

对生物体包括人类自身的基因组进行高效自由地操作是许多生命科学和医学工作者的梦想。CRISPR/Cas9技术简单、高效，也不失精准。它已经成为基因组工程的有力工具。它在生命科学基础研究、生物技术和医药领域有广泛的应用前景。在医药领域，利用它可以快速建立疾病模型，可以进行基因治疗和新药开发。

miRNA自从发现之日起，一直被人们所关注，特别是在生物标志物领域，已经有不少miRNA被证实与肿瘤的发生、发展有关联。在现有的研究领域中，miRNA在后期的功能研究中，大多采用mimic抑制物敲降表达，来研究靶基因的调控过程。而CRISPR/Cas9作为DNA水平的研究利器，如同一把精准的“手术刀”，可以快速找到microRNA前体的发夹结构5’侧翼和3’侧翼序列，并将其切下，如此构建的细胞系是miRNA完全缺失的细胞系。这种缺失，可以使靶基因的表达不再受该miRNA的控制，让表型的鉴定更加明晰！因此，有了CRISPR/Cas9，miRNA的敲除研究正日益成为miRNA功能研究的新方向。

上海伯豪作为国内最专业的高通量技术引领者之一，与国内多家顶尖单位合作，发表了很多重量级的研究。其中与中山医院复旦大学中山医院肝癌研究所樊嘉教授领衔课题组成功合作了JCO杂志：

在此基础上，CRISPR/Cas9可以分别将这7个miRNA在肝癌细胞中进行敲除，或者同时敲除，可以研究miRNA在肿瘤中调控机制：

     接着，可以利用伯豪公司miRNA芯片或miRNA测序服务，研究这些miRNA的删除对下游哪些通路、基因、miRNA、lncRNA、circRNA造成影响：

miRNA测序：

全转录组测序：

并结合伯豪公司IPA分析，构建miRNA缺失情况下的基因表达调控研究：

后期分析：

1） Canonical pathways analysis

图1 pathway差异显著性和激活抑制情况柱形图

2） Diseases and Bio Functions

图2 Diseases和Bio Functions总体分布块状图

3） 基因的信号通路网络图

图3 基因表达与调控信号通路网络图

4）上游调控分析

图4 上游调控因子EOME1与下游调控关系网络图

5） 调控机制分析

     上海伯豪在经过一年多的自主摸索，在历经无数次失败之后，摸索出一套稳定的细胞建系流程。已经成功实现了肝癌、胃癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞的miRNA敲除项目，为了让国内更多miRNA研究领域的课题组可以获得miRNA敲除的细胞系，以便开展课题申报，或miRNA基础科研，上海伯豪决定正式对国内科研领域承接miRNA基因敲除CRO服务。

服务内容：miRNA基因删除细胞建系

服务范围：仅限肿瘤细胞系

服务流程：

服务周期：3-5个月左右（视不同肿瘤细胞系、不同miRNA的sgRNA删除活性而定）

附经典文章：

miRNA显现治疗骨病巨大潜力

研究者用qPCR检测了骨髓中破骨细胞在刺激物处理后与癌症相关的miRNA丰度变化，发现序列保守的miR-34a与破骨细胞生长呈负相关关系，进一步体内及体外实验也证明miR-34a会抑制破骨细胞产生。另外，通过构建miR-34a敲除及杂合小鼠，检测血清中骨转移标志物CTX-1（carboxy-terminal telopeptides of type I collagen），发现miR-34a在抑制破骨细胞生长的同时，也一并抑制了破骨细胞所参与的骨吸收作用，从而在不影响成骨细胞数目、骨骼生产速度和骨矿沉积率的情况下，增加骨量。

初步了解了miR-34a的功能之后，研究者希望了解miR-34a是否可以作为某些骨吸收相关疾病的标志物。他们使用一类无毒壳聚糖纳米颗粒修饰的miR-34a mimics（miR-34a-CH）处理卵巢切除小鼠（OVX小鼠），力图了解miR-34a对骨吸收相关的骨质疏松症的调控。结果表明，小鼠卵巢切除所引起的CTX-1上升被显著遏制，骨缺失得到修复，骨生成增加，骨量提高；此后，在两类癌细胞移植动物模型活体成像实验中，研究者发现miR-34a-CH处理可以明显减弱癌细胞骨转移， 同时还会抑制肿瘤生长及癌细胞向其他器官，但如果在注射之前用miR-34a-CH提前处理癌细胞，则不会有这类效果。这些结果说明，miR-34a确实会通过对破骨细胞及骨吸收的调控，影响骨质疏松症及癌细胞骨转移。

最后，研究者使用软件预测、qPCR、3’UTR荧光素酶报告基因等经典手段，发现破骨细胞中的转化生长因子-β诱导因子2（transforming growth factor-b-induced factor 2，Tgif2）是miR-34a在破骨细胞中的直接靶基因。敲除Tgif2可以降低小鼠骨吸收，减少破骨细胞，若同时敲除Tgif2及miR-34a，小鼠骨吸收及破骨细胞亦不会增加；进一步的分析发现，Tgif2是一个破骨细胞调控因子，会与某些转录因子形成一个正反馈回路，加强破骨细胞生成。miR-34a即通过调控此靶点，利用其信号通路，对破骨细胞和骨吸收产生影响。

miR-34a对破骨细胞及骨吸收调控示意图

相关文献：Krzeszinski J Y, Wei W, Huynh H D, et al. miR-34a blocks osteoporosis and bone metastasis by inhibiting osteoclastogenesis and Tgif2[J]. Nature, 2014, 512(7515): 431-435.
下载链接：http://www.uab.edu/medicine/camac/images/miR-34a_osteoclast_paper.pdf

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