MTT/CCK8/XTT/Transwell细胞迁移侵袭实验

细胞增殖、毒性检测

实验介绍

(a) MTT

MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料。活细胞在琥珀酸脱氢酶和细胞色素c的作用下四唑环开裂，生成蓝色的甲月替结晶并沉积在细胞中，甲月替结晶的生成量仅仅与活细胞数目成正比（死细胞中的琥珀酸脱氢酶消失，不能还原MTT）。还原生成的甲月替结晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺、20%的十二甲基磺酸钠（PH 4.7）或10%酸化十二甲基磺酸钠（PH 4.7）的溶液中溶解。利用酶标仪测定490nm波长处的光密度测出OD值，即反映活细胞数目。也可利用DMSO（二甲基亚砜）来溶解。用DMSO之前要尽量去掉培养液，一遍DMSO溶解甲月替颗粒，进行比色测定。

1．取96孔细胞培养板，每孔中加0.1ml含2×10⁴～10×10⁴靶细胞的培养液（含10％小牛血清的RPMI-1640培养液），在37℃ 5％ CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养2～3小时让细胞帖壁（如果是悬浮细胞可直接进行下一步）

2．用RPMI-1640培养液2～10倍递次稀释细胞因子标准品，根据情况2～5倍递次稀释待检样品，每孔加0.1ml稀释的标准品和待检样品，每个稀释度3个重复孔。对照孔6个：3个阳性对照孔，每孔加0.1ml含大剂量细胞因子的RPMI-1640培养液，3个阴性对照孔，每孔加0.1ml RPMI-1640培养液。在37℃ 5％ CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养24～48小时或预定的时间。

3．吸去培养液，用PBS洗涤一次（如为悬浮细胞，应在吸去上清液前离心培养板）。

4．每孔加0.1ml PBS和10μl MTT染液，在37℃ 5％ CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养4～6小时。

5．每孔加0.1ml酸化异丙醇，也可用含10％ SDS的10mmol/L HCl代替酸化异丙醇，在振荡器上振荡混匀，让还原产物充分溶解。置酶联检测仪上测定光密度（OD）值，检测波长570nm，参考波长630nm。以OD值对样品稀释度作图，比较标准曲线和待测样品曲线即可求得待测样品中细胞因子的含量。

(b) CCK-8检测细胞增殖（活力）：

CCK-8（cell-counting kit-8）检测试剂盒是应用WST-8取代MTT被还原，WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。WST-8产生的formazan比XTT和MTS产生的formazan更易溶解。且WST-8相较XTT和MTS化学性状更稳定， 因此实验结果相对更加稳定。此外，WST-8相较MTT、XTT，线性范围相对宽，灵敏度更高。 

当细胞增殖得越多越快，则formazan产生量越多，颜色越深；反之，当内外因造成的细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。应用酶标仪测定吸光值并进行统计学计算便可以获得细胞增殖（活性）相关数据。

(c) XTT：

化学名：2,3- bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl] -2H-tetrazolium hydroxide，作为线粒体脱氢酶的作用底物，被活细胞还原成水溶性的橙黄色甲臢产物。当XTT与电子偶合剂（例如PMS）联合应用时，其所产生的水溶性的甲臢产物的吸光度与活细胞的数量成正比。

用XTT代替MTT可省去溶解还原产物结晶的步骤，XTT可以被活细胞中的代谢酶还原成黄色水溶性的代谢产物（formazan）。代谢产物在OD450处有吸收峰。

优点：1、使用方便，省去了洗涤细胞；2、检测快速；3、灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度；4、重复性优于MTT。

缺点：XTT水溶液不稳定，需要低温保存或现配现用。

应用范围：

生物活性因子的活性检测；

大规模的抗肿瘤药物筛选；

细胞增殖实验；

药物或基因导致的细胞毒性试验；

药敏试验等。

服务周期：3周。

Transwell 细胞迁移实验

一、实验介绍

细胞迁移与侵袭实验将 Transwell 小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

二、实验步骤

1、材料准备：

可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫）

2、步骤和流程

2.1基质胶铺板：

用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。

2.2制备细胞悬液

①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。

②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×10⁵/ml。

2.3接种细胞

①取细胞悬液100 ul 加入Transwell小室。

② 24孔板下室一般加入600 uL含20% PBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。

③培养细胞：常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。24h较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。

2.4结果统计

直接计数法，“贴壁”细胞计数，这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去，通过给细胞染色，可在镜下计数细胞。

取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用无钙的PBS洗2遍，甲醇固定30分钟，将小室适当风干。

0.1%结晶紫染色20 min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗3遍。

400倍显微镜下随即五个视野观察细胞，记数。

实验周期：

 1个月

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