核体系酵母文库构建

核体系酵母文库构建/均一化cDNA文库构建/全长cDNA文库构建/Fosmid文库构建

核体系酵母文库构建

酵母双杂交（Yeast two hybrid）技术是利用酵母遗传学方法分析蛋白质之间的相互作用，已被广泛应用于蛋白质组学、细胞信号转导和功能基因组学等领域，已成为分子生物学研究领域的重要实验手段。经过不断的完善和发展，不但可以检测已知蛋白质之间的相互作用，更重要的是还可发现与已知蛋白相互作用的未知蛋白。

推出两套酵母双杂交文库构建体系：
一是SMART体系，在现有酵母双杂交文库构建流程（BD MatchmakerTM library）基础之上加入独特步骤，使文库中高丰度表达基因明显降低，从而使文库丰度均一提高筛选阳性率；
二是Gateway体系，采用Gateway位点特异性重组技术（Cloneminer cDNA library construction kit）构建文库。

应用领域：
检测细胞核内发生互作的蛋白质，基于转录因子的转录激活域AD与DNA结合域BD分别构建融合基因 ，通过激活报告基因表达，探测蛋白互作。
部分物种：人、小鼠、大鼠、对虾、水稻、拟南芥、牡丹、稻飞虱、苹果、油菜、小麦、烟草、银杏、土豆、西瓜、棉花。

均一化cDNA文库构建

均一化cDNA文库是克服基因转录水平上巨大差异给文库的筛选和分析带来障碍的有效措施，有利于研究基因的表达和分析。现在，在构建均一化cDNA文库中至少有两种主要的观点。一种是基于复性动力学的原理，高丰度的cDNA在退火下复性速度快，而低丰度的cDNA复性要很长时间，从而可以通过控制复性时间来降低丰度；另一种是基于基因组DNA在拷贝数上具有相对均一化的性质，通过cDNA和DNA的饱和杂交而降低在文库中高拷贝存在的cDNA的丰度。我们主要通过第一种方法实现均一化，以达到降低基因间拷贝数差异，有助于低拷贝基因的筛选。

操作流程

• RNA提取

• mRNA分离

• cDNA合成与均一化处理

• cDNA长度分级

• 分级后的cDNA与目的载体的all-direct重组

• 重组产物电转化

均一化cDNA文库的鉴定
检测库容量（总CFU）；随机挑取32个克隆子，PCR方法检测平均插入片段大小；抽提均一化cDNA文库的混合质粒（大抽），qPCR检测均一化前后两个文库总质粒中两个看家基因的表达量差异，以判断均一化的效果。

送样要求

针对每个文库，客户需提供200ug以上的RNA或2g以上的组织样本。

结果提供

我们提供构建好的cDNA文库的甘油菌液（含20%甘油的LB培养基），随机克隆子的PCR鉴定图谱，文库构建报告。

全长cDNA文库构建

我们提供高全长比例的文库构建服务，全长比例可以高达85%以上。

普通全长cDNA文库构建

操作流程

• 客户样品QC，Total RNA的提取。

• mRNA的分离。

• 采用CAP Trapper法进行全长mRNA的富集。

• 以mRNA为模板进行cDNA双链的合成。

• 对合成的cDNA双链进行分级纯化。

• 将分级纯化的cDNA与载体进行all-direct重组反应。

• 将重组产物转化DH10B感受态细胞。

• cDNA文库的QC。检测文库库容量；每个文库随机挑取32个克隆子，PCR检测检测平均插入片段大小，阳性率； 随机挑取24个克隆进行正向测序，通过NCBI的BLSTAX分析全长率。

送样要求

针对每个文库，客户需提供至少能提取500ug总RNA的样本，或者至少500ug的总RNA。

结果提供

我们提供构建好的cDNA文库的甘油菌液（含20%甘油的LB培养基），随机克隆子的PCR鉴定图谱，24个克隆正向测序报告，文库构建报告。

Fosmid文库构建

提供高质量，高库容量的Fosmid文库构建服务

操作流程

• 样本的QC

• 高质量基因组DNA的提取，基因组DNA的打断处理

• 打断后的DNA连接到载体

• 连接产物的包装和侵染大肠杆菌细胞

• fosmid文库的检测：检测库容量（总CFU）；随机挑取16个克隆子，抽提质粒，酶切检测插入片段大小与阳性率。

结果提供

我们提供构建好的fosmid文库的甘油菌液（含20%甘油的LB培养基），随机克隆子的质粒酶切鉴定电泳图，文库构建报告。

威斯腾实验服务流程

威斯腾生物服务项目

【本平台合作项目】 

分子生物学、细胞生物学、病理染色检测、细胞敲除&敲入、模式与转基因动物、SPF动物保种、免疫学检测、影像学检测、原代培养、细胞药筛、CRISPR/Cas9基因编辑、基因芯片、高通量测序、蛋白组学、代谢组学、高通量高内涵筛选、药效学评价、药理毒理学实验、慢病毒包装与稳转株建立、SiRNA与纳米载药、ChIP、CO-IP、生物信息学分析、知识产权服务！

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