EHJ | 琥珀酸或是主动脉瘤和夹层的标志物及治疗靶点

主动脉瘤和夹层（AAD）是高风险的心血管疾病，目前还没有有效的药物可以预防AAD的发生和发展。巨噬细胞在AAD的发展中起重要作用。而琥珀酸盐会引发巨噬细胞的炎症变化。北京大学基础医学院心血管研究所郑乐民教授团队与华中科技大学附属同济医院汪道文团队首次报道琥珀酸可以作为AAD诊断的新型生物标志物，血浆中高浓度琥珀酸加重小鼠AAD的进展，抑制巨噬细胞内琥珀酸生成通路p38α-CREB-OGDH轴，有效抑制琥珀酸积累，缓解AAD的进展，为AAD的治疗提供新的靶点。相关成果发表于《European Heart Journal》。

研究重点解析

(1)琥珀酸是发现队列中上调最显著的代谢物；这在验证队列中得到证实。

(2)血浆琥珀酸浓度可区分AAD患者、急性心肌梗死(AMI)、肺栓塞(PE)患者和健康对照。

(3)琥珀酸给药加重了小鼠血管紧张素 II 诱导的 AAD 和血管炎症。

(4)氧代戊二酸脱氢酶(OGDH)的敲低降低了巨噬细胞中炎症因子的表达。 

(5)巨噬细胞中的琥珀酸浓度由 p38α-CREB-OGDH 轴调节。

1. 代谢组学揭示主动脉疾病患者血浆琥珀酸浓度升高

在发现队列中，纳入20例主动脉疾病患者（包括5名A型AD（主动脉夹层）、7名B型AD和8名AAA（腹主动脉瘤））以及20例年龄、性别和合并症匹配（包括吸烟和饮酒状况，以及高血压和糖尿病史）的健康对照，进行代谢组学。结果显示，在所有主动脉疾病患者和健康对照之间有119种代谢物存在显著差异。其中，琥珀酸是上调最显著的代谢物。

在验证队列中，纳入1665例个体，包括700例主动脉疾病病例（241名A型AD、374 名B型AD和85名AAA）、199名AMI 病例、74名PE病例和692名健康对照，通过靶向代谢方法进行验证。结果显示，与健康对照者相比，主动脉疾病患者的琥珀酸浓度升高。与发现集中的结果保持一致，A型AD、B型AD和AAA患者的琥珀酸水平较高。随后对两个队列数据进行综合分析，发现血浆琥珀酸浓度较高的个体患主动脉疾病的风险显著增加。对年龄、性别、吸烟和饮酒习惯、高血压和糖尿病史以及收缩压等常见危险因素校正后，血浆琥珀酸浓度仍然是一个独立的预测因子（图1）。

2. 血浆琥珀酸浓度对主动脉疾病的诊断性能

使用受试者工作特征曲线下面积 (AUROC) 评估琥珀酸预测AAD的能力，曲线下面积为0.83，比基线（包括年龄、性别、吸烟、饮酒、高血压病史、和糖尿病和收缩压）模块（AUROC = 0.79，）具有更好的判别性能。此外，基线加琥珀酸组合AUROC（0.87）在统计学上具有更高的判别性能。同时，决策曲线分析（DCA）是一种用于评估替代诊断策略的新方法，与AUROC方法相比具有优势。DCA分析结果与AUROC保持一致，以上研究表明血浆琥珀酸测试具有潜在的临床应用价值。

主动脉疾病、AMI和PE是具有相似症状但需要不同治疗策略的疾病。因此，区分这三种疾病至关重要。招募199名 AMI患者和76名PE患者，以确定是否有任何生化参数可以可靠地区分主动脉疾病与AMI和PE。结果表明，与AMI患者和PE患者相比，主动脉疾病患者的血浆琥珀酸浓度显著增加。AMI和PE患者与健康对照的AUROC值分别为0.63和0.53。主动脉疾病患者与AMI和PE患者的AUROC值分别为0.9和0.80。因此，血浆琥珀酸浓度具有很好的诊断性能，且能区分主动脉疾病患者与健康对照以及AMI和PE患者（图1）。

图1 琥珀酸可以提高主动脉疾病的诊断性能

3. 琥珀酸加剧小鼠AAD的形成

为确定琥珀酸在AAD中的作用，向小鼠施用琥珀酸或空白对照载体，并构建BAPN/血管紧张素II（Ang II）诱导的第一个AAD模型。结果显示，琥珀酸给药增加了小鼠死亡率（41.7%对71.4%）、AAD发生率（67% 对 100%），且在第31天时增加了升主动脉、主动脉弓和降主动脉的直径，由于琥珀酸组中仅剩下3只小鼠，无统计学显著性结果。与空白对照组相比，琥珀酸给药增加了主动脉病理状况，也增加了脉管系统中ROS的水平。给Apoe^–/–小鼠施用琥珀酸或空白对照，然后注射Ang II 28天诱导第二个AAD模型。结果线上，与空白对照相比，琥珀酸给药增加AAD发生率（60% 到100%）。与对照小鼠相比，琥珀酸给药小鼠的最大主动脉直径显着增加。值得注意的是，本研究进一步证实补充琥珀酸会加重BAPN诱导的 AAD（第三个AAD模型）。接受含有1.5%琥珀酸盐水的小鼠AAD的发生率增加，主动脉直径增加。（图 2）

图2 补充琥珀酸在体内加重主动脉瘤和夹层

4. 抑制酮戊二酸脱氢酶可减少巨噬细胞介导的炎症

据报道，与脂多糖 (LPS) 一起孵育的巨噬细胞中琥珀酸浓度增加，从而促进 IL-1b 表达并增强促炎巨噬细胞反应。巨噬细胞可以将琥珀酸释放到细胞外环境中。在TCA循环中，琥珀酸是通过由氧代戊二酸脱氢酶(OGDH)介导的α-酮戊二酸氧化脱羧合成的。已证明 LPS 刺激后巨噬细胞中的OGDH活性显著增加，促进琥珀酸的积累。AAD组织切片结果显示，巨噬细胞中OGDH显著增加，表明OGDH可能在AAD中发挥重要作用。通过siRNA敲低 Ogdh基因减轻了用LPS刺激24小时的骨髓源性巨噬细胞(BMDM)的炎症，同时Il1b和 Nos2 的mRNA表达水平降低，OGDH和pro-IL-1b的蛋白表达水平降低。Ogdh敲低后琥珀酸的浓度显著降低。此外，琥珀酰膦酸酯（一种OGDH的特异性抑制剂）处理后，在Il1b和 Nos2的mRNA表达水平下调，pro-IL-1b 的蛋白含量表达下调（图3）。

图3 抑制OGDH可降低巨噬细胞炎症因子的表达

5. CREB调控Ogdh 转录

根据染色质免疫沉淀（ChIP）-seq数据库（http://rna.sysu.edu.cn/chipbase3/），转录因子环磷酸腺苷反应元件结合蛋白1（CREB）可以与Ogdh启动子区域结合。双荧光素酶报告基因结果显示，与空白对照组相比，CREB的过表达导致Ogdh启动子激活。根据 ChIP 分析，CREB与BMDM中Ogdh的启动子区域结合。为证明CREB调节巨噬细胞中的OGDH表达，使用siRNA敲低Creb1 基因，从而降低LPS处理的BMDM中的OGDH和pro-IL-1b表达水平。在与选择性CREB抑制剂666-15孵育的BMDM中获得了类似结果。同时发现，AAD中巨噬细胞中CREB的磷酸化（p-CREB）水平在显著增加。此外，在三个独立的公共主动脉疾病数据库中，CREB和OGDH的表达水平呈现显著正相关（图4）。

图4  CREB通过直接启动子结合调节OGDH 表达

6. p38α对CREB的磷酸化促进琥珀酸产生和巨噬细胞炎症反应

CREB是一种广泛表达的转录因子，其活性受多种激酶的调控。已报道，在 LPS 刺激下，CREB被p38α磷酸化。本文进一步研究了p38α在调节琥珀酸产生中的作用。通过将 p38α-flox 小鼠p38α^fl/fl与LysM-Cre小鼠杂交获得p38α髓样缺失小鼠p38α^MKO。结果显示，与p38α^fl/fl小鼠相比，p38α^MKO小鼠的LPS处理的BMDM中p-CREB水平更低，验证了p38α在LPS刺激后磷酸化CREB的观点。免疫沉淀实验表明，p38α结合到CREB上。p38α缺失在mRNA和蛋白质水平下调了OGDH的表达，并且降低了BMDM中琥珀酸的含量。结果还发现p38α^MKO小鼠BMDMs中pro-IL-1b的表达低于p38α^fl/fl小鼠。在p38α缺失小鼠中LPS刺激的BMDM中炎症因子表达降低，包括编码巨噬细胞促炎因子（Nos2、Hif1a、Il1b、Ccl2）的基因表达水平降低，并且M1促炎巨噬细胞的比例和细胞内ROS的表达水平均降低（图5）。

图5 p38α通过CREB磷酸化调节OGDH和琥珀酸的表达来影响巨噬细胞炎症表型

7. 巨噬细胞中p38α缺失减弱了AAD的形成

用p38α 条件特异性抑制剂SB203580处理野生型小鼠。该化合物抑制了弹性蛋白酶诱导的AAA的进展。将p38α^MKO和p38α^fl/fl小鼠与Apoe^–/–小鼠杂交以获得 p38α^MKO Apoe^–/– 和 p38α^fl/fl Apoe^–/– 小鼠。结果显示，与野生型同窝小鼠相比，注入Ang II的 p38α^MKO Apoe^–/– 小鼠AAD的发生率降低，主动脉直径变短。H&E染色显示，p38α^MKO Apoe^–/– 小鼠的壁厚和平滑肌细胞的损失少于其野生型同窝小鼠。EVG染色显示，巨噬细胞中p38α的缺失抑制了弹性蛋白的降解。在p38α^MKO Apoe^–/–小鼠中，AAD中的巨噬细胞浸润降低，尤其是M1促炎巨噬细胞，表明主动脉炎症减弱。在注入 Ang II 3天或7天的小鼠中也观察到一致现象。此外，免疫组织化结果显示，与 p38α^fl/f Apoe^–/– 小鼠相比，p38α^MKO Apoe^–/– 小鼠的主动脉炎症因子，如MMP9、IL-6、单核细胞趋化蛋白-1 MCP1、TNF-a和IL-1b的表达水平降低（图6）。

图6 巨噬细胞特异性 p38α 缺失减弱血管紧张素 II 诱导的AAD

小结

本研究通过代谢组学测定了40名和1665名发现和验证组个体的血浆琥珀酸浓度，发现主动脉夹层和主动脉瘤等主动脉疾病患者的血浆琥珀酸显著升高。而抑制巨噬细胞内琥珀酸生成通路p38α-CREB-OGDH轴，有效抑制琥珀酸积累，进而缓解AAD的进展。该研究发现血浆琥珀酸能作为诊断AAD的新型标志物，琥珀酸相关信号通路有望成为治疗AAD的潜在靶点。

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参考文献

Untargeted metabolomics identifies succinate as a biomarker and therapeutic target in aortic aneurysm and dissection. European Heart Journal.2021.https://doi.org/10.1093/eurheartj/ehab605.

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