Analytical Chemistry | 研无止境--Q300全定量方法学闪耀出圈
随着代谢组学的发展与研究认识的不断深入，越来越多的代谢组学专家学者逐步深刻认识到代谢组学方法必须从早期兴起的非靶向定性分析过度到靶向绝对定量检测分析，绝对定量获得代谢物的准确浓度才能更快的实现临床转化，并精准匹配大量临床队列样本的检测需求。但由于代谢物的化学多样性及浓度范围差异性巨大等原因，想要在一个方法下实现成百甚至上千种代谢物的绝对定量检测困难重重。近日，上海市第六人民医院转化医学中心主任&麦特绘谱创始人贾伟教授研究团队基于化学衍生法开发的UPLC-TQMS代谢组学检测方案，可以对324种不同类别代谢物实现同时绝对定量检测分析，并经过多个临床队列样本的验证，相关方法学成果于2021年4月2日成功发表分析方法学类顶刊《Analytical Chemistry》。麦特绘谱已将该方法成功生产为质谱试剂盒产品，可在Waters、Sciex、Agilent、Thermo、Shimadzu等各大厂商质谱平台应用，同时配置TMBQ数据处理软件。此外，麦特绘谱拥有自主研发的数据分析云平台（iMAP），更有最专业的技术支持团队加持，可以为科研及临床研究工作者提供标准化、一站式代谢组学整体解决方案。
一、Q300全定量检测方法学考察
图1 Q300代谢芯片的分析流程
线性和定量限：根据代谢物和内标的峰面积比与代谢物浓度作图，获得校正曲线。根据代谢物标准品一系列不同浓度，通过线性回归模型确定响应线性。大多数代谢物的线性相关系数（R2）均大于0.9900，且具有较宽线性浓度范围的检测能力，通过自主开发的TMBQ软件提供相应的信噪比（S/N），可以快速确定每种化合物的定量限。
重现性：通过标准混合物和生物样本（人血清、尿液、粪便、细胞和小鼠肝脏等）考察了自动衍生化技术和UPLC-TQMS的方法重现性。六种独立制备的标准混合物和样品分别进行连续重复测量分析。在人血清、尿液、粪便样品、HepG2细胞和小鼠肝脏样品中鉴定出的大多数测试化合物和代谢物均具有优异的重现性，相对标准偏差（RSD）小于15％。
回收率：分别采用人血清、尿液、粪便、细胞和小鼠肝组织样品进行加样回收实验考察代谢物回收率。大多数代谢物具有良好的准确度，回收率在80%～120%之间，CV小于15%。
图2 （a）Q300代谢芯片技术可测的代谢物类别；（b）3-NPH衍生化过程；（c）质控图
代谢物衍生化数据库：研究团队首先开发了由324个代谢物标准品的3-NPH衍生物组成的MS/RT库。该数据库涵盖了许多化学类别代谢物（图2A），包括氨基酸（18％）、胆汁酸（12％）、苯甲酸酯（7％）、碳水化合物（7％）、脂肪酸（含短链脂肪酸）（ 24％）、吲哚（2％）、肉碱（6％）、有机酸（13％）和其他（11％）。代谢物3-NPH衍生反应如图2B所示。
方法学应用: 分别对HepG2细胞、小鼠肝脏、人血清、尿液和粪便等生物样本进行代谢物检测分析。每个样本均采用自动化衍生法及LC-TQMS检测分析。每10个研究样本间插入一个QC样本，QC样本可以评估衍生化和仪器的变异性，通过混合样品制备QC样本。质量控制对于确保代谢物定量的可重现性、可靠性、准确性和稳健性至关重要。如主成分分析（PCA）评分图所示（图2C），QC样品相对于其余的血清、尿液和粪便样品成簇紧密结合，表明该方法具有良好的重现性。
二、Q300全定量代谢芯片试剂盒
基于Q300全定量分析方法，目前开发了首款涵盖多代谢物类群的Q300全定量代谢芯片试剂盒（简称：Q300试剂盒），并大量应用于科研检测及临床研究。该试剂盒包含所有参考标准混合物（具有系列稀释浓度）、QC样本、内标、稀释后的内标溶液、96孔板、96孔铝箔和96孔板粘合膜。该技术已获得发明专利和产品注册证（专利号：No.ZL201811223486.X，粤深械备20210363）。
临床应用: 采用Q300试剂盒，对1234例慢性肝病合并慢性乙型肝炎（HBV）感染患者（31例单纯乙肝患者、117例1期肝纤维化患者、105例2期肝纤维化患者、45例3期肝纤维化患者、51例肝硬化患者，467例肝细胞癌患者（HCC）、76例肝内胆管癌患者（ICC）和342例健康对照者)进行代谢组学研究。共使用26个试剂盒对所有样品进行分析，每个试剂盒内含有5个合并的QC样品。以PCA的第一个主成分（PC1）为y轴，以进样顺序为x轴，建立多变量控制图（MCC）如图3a所示，测试过程中的波动均在一个标准偏差（±1SD）内，表明测试稳定可靠。PCA模型（R2X = 0.471，Q2cum = 0.257，图3b）、交叉验证的正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）（R2X = 0.296，R2Ycum = 0.865，Q2cum = 0.846）和热图（图3c）均证实，正常、肝纤维化和肝癌人群的代谢谱具有明显的可分性，大量代谢物的浓度在三组之间有显著差异。
图3 （a）测试过程的多变量控制图；（b）正常、肝纤维化和肝癌人群血清定量代谢谱的PCA图；（c）正常、肝纤维化和肝癌人群血清中287个代谢物浓度的热图
值得注意的是，癸二酸、辛酰基肉碱、十五烷酸、L-天冬氨酸、2-甲基戊酸、苏糖酸、L-色氨酸、赤藓酸、3-甲基-2-氧代戊酸、L-谷氨酸、L-缬氨酸、L-苯丙氨酸这些代谢物在对照组中含量丰富，在纤维化和癌症患者中水平逐渐降低。与健康对照组相比，肝病患者L-酪氨酸、γ-氨基丁酸、乙醇酸、葡萄糖、2-羟基丁酸、酮戊二酸、甘脱氧胆酸、牛磺脱氧胆酸、甘脱氧胆酸、甘胆酸、牛磺胆酸和牛磺脱氧胆酸水平增加（图4a）。进一步根据不同的诊断目标，基于显著改变的代谢物（图4a、4d和4g）构建一系列组合变量，其区分健康对照和纤维化患者（图4b）的ROC曲线下面积（AUC）为1.000，区分纤维化和肝癌的AUC为0.990（图4c），区分肝纤维化与肝硬化的AUC为0.969（图4e），区分HCC和ICC的AUC为0.799（图4f）。
图4（a）正常、肝纤维化和肝硬化之间的差异代谢物浓度的热图；（b）基于a中代谢物的组合变量区分对照组和纤维化患者的ROC曲线；（c）基于a中代谢物的组合变量区分肝纤维化和肝癌患者的ROC曲线；（d）肝炎、纤维化不同时期和肝硬化之间的差异代谢物浓度的热图；（e）基于d中代谢物的组合变量区分肝纤维化与肝硬化患者的ROC曲线；（f）基于g中代谢物的组合变量区分肝细胞癌和胆管细胞癌患者的ROC曲线；（g）肝细胞癌和胆管细胞癌之间的差异代谢物浓度的热图。
三、Q300试剂盒跨国平台转移
可喜的是目前Q300试剂盒已成功转移至代谢组学之父Jeremy Nicholson实验室并大量应用于大队列样本检测分析。Nicholson教授系英国皇家医学科学院院士，现任帝国理工大学医学院外科与肿瘤系主任，MRC-NIHR表型组研究中心主任，复旦大学荣誉教授，其最广为人知的学术成果在于明确提出了“代谢组学”的概念，并建立了系统的代谢组学研究方法，开辟了全新的研究领域，被誉为“代谢组学之父”。Q300试剂盒在Jeremy Nicholson实验室成功转移及应用标志着该试剂盒的稳定性、可靠性等方面均得到高度认可。此外，该试剂盒在绿谷制药、华大基因、郑州大学第一附属医院、上海中医药大学附属曙光医院，上海市精神卫生中心、华中科技大学协和深圳医院、江苏省食品药品监督检验研究院等多客户端大量应用中，得到了科研及临床研究工作者们的一致好评!
参考文献
Guoxiang Xie, Lu Wang, Tianlu Chen, Kejun Zhou, Zechuan Zhang, Jiufeng Li, Beicheng Sun, Yike Guo, Xiaoning Wang, Yixing Wang, Hua Zhang, Ping Liu, Jeremy K. Nicholson, Weihong Ge, Wei Jia. A Metabolite Array Technology for Precision Medicine. Analytical Chemistry. 2021, 3/29/2021 15:32:47. https://doi.org/ 10.1021/acs.analchem.0c04686.
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