Cell Metabolism | 丁酸盐激活5-HIAA-Bregs-AhR轴抑制关节炎

类风湿性关节炎(RA)是一种由白细胞功能失调引起的疾病，研究数据显示肠道细菌或微生物群的变化可影响RA的正常免疫系统功能。调节性B细胞(Bregs)是一种免疫抑制细胞，它通过产生白细胞介素(IL)-10, IL-35和转化生长因子-1 (TGFβ1)介导免疫耐受，从而抑制多种免疫病如自身免疫性疾病。英国伦敦大学学院Claudia Mauri和Elizabeth C. Rosser研究团队发现补充丁酸盐可改变微生物群的组成，增加血清素衍生代谢物5-羟基吲哚-3-乙酸（5-HIAA）的产生，激活芳烃受体(AhR)抑制生发中心(GC) B细胞和浆细胞的分化以维持Bregs功能从而改善关节炎，相关成果发表于《Cell Metabolism》。

RA患者粪便丁酸盐降低与CD19⁺CD24^hiCD38^hiB细胞和IL-10⁺Breg频率降低相关

肠道微生物群的生态失调可能是RA发病的一个促进因素，本研究团队已报道CD19⁺CD24^hiCD38^hiB细胞中高比例的IL-10⁺Bregs的频率与RA严重程度呈负相关。微生物来源的SCFAs对维持免疫稳态至关重要，因此，作者推测RA的生态失调可能影响SCFAs，导致B细胞稳态异常和Breg频率降低。本研究招募非活动性RA患者收集粪便和血清样本进行代谢组学分析，发现与年龄和性别匹配的健康对照(HCs)相比，RA患者粪便中丁酸盐和丙酸盐显著减少，而乙酸盐没有差异(图1A)。在RA患者中丁酸盐水平与总CD19⁺CD24^hiCD38^hiB细胞和IL-10⁺B细胞的频率呈显著正相关(图1D,1G)。丙酸盐或乙酸盐与CD19⁺CD24^hiCD38^hiB细胞或IL-10⁺Breg频率无明显相关性(图1B-1F)，表明丁酸盐在维持关节炎疾病中Breg稳态方面起作用。

丁酸盐依赖于Bregs抑制实验性关节炎

对抗原诱导的关节炎模型(AIA)小鼠粪便SCFA水平进行分析，发现与关节炎前小鼠相比，急性期和缓解期关节炎小鼠丁酸盐和乙酸盐含量下降(图2A, S2A)。为评估个体SCFA在控制关节炎严重程度方面的作用，并确定B细胞在介导抑制中的可能作用，疾病诱导前在野生型(WT)小鼠和B细胞缺陷(μMT)小鼠的饮用水中添加乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐，发现与对照组(两种基因型的对照小鼠均接受盐和pH平衡的饮用水)相比，仅补充丁酸盐就可以减轻WT小鼠关节炎(图2B)。而丁酸盐未能抑制μMT小鼠疾病情况(图2C)，表明在实验条件下B细胞是实现丁酸盐有利效应的关键。在缺乏产生IL-10的B细胞混合骨髓嵌合小鼠中，补充丁酸盐未能抑制关节炎(图2b)，表明丁酸盐介导的关节炎抑制需要Bregs。丁酸盐能抑制胶原诱导性关节炎的严重程度，进一步说明丁酸盐在关节炎中的抗炎作用(图S2F)。

补充丁酸盐使B细胞室倾斜有利于调节表型

利用IL-10eGFP报告基因小鼠的优势，使活跃转录IL-10的B细胞可视化以研究丁酸盐对促关节炎的细胞和Bregs的影响。补充丁酸盐的IL-10eGFP报告基因小鼠的疾病改善与野生型小鼠相似（图2C和2D分别显示了关节的临床评分和组织学变化）。在丁酸盐对Bregs分化影响方面，补充丁酸盐的小鼠和对照组小鼠IL-10eGFP⁺CD19⁺CD21^hiCD24^hiBreg数目和频率相似(图2E)，CD19⁺CD138⁺Blimp-1⁺浆母细胞和CD19⁺CD95⁺GL7⁺GC（生发中心）B细胞的频率和数量显著降低(图2F和2H)。盲法组织学分析进一步证实，补充丁酸盐的小鼠和对照组小鼠每个B细胞卵泡的GCs数量和大小减少（图2J）。因此，与对照组小鼠相比，丁酸盐的添加增加了IL-10eGFP⁺CD19⁺CD21^hiCD24^hiBreg相对于浆母细胞与IL-10eGFP⁺CD19⁺CD21^hiCD24^hiBreg相对于GC B细胞的比例(图2G和2I)。为了确定丁酸盐是否会影响Bregs免疫抑制功能，从补充丁酸盐或对照IL-10eGFP报告小鼠中分离同等数量的IL-10eGFP⁺CD19⁺CD21^hiCD24^hiBregs并转移到同基因关节炎宿主中，结果显示相比对照组，丁酸盐补充小鼠的IL-10eGFP⁺CD19⁺CD21^hiCD24^hiBregs在过继转移时发挥了更强的抑制能力(图2K)。综上结果表明，补充丁酸盐同时增加Breg抑制能力，限制GC B细胞和浆母细胞的分化。

丁酸盐抑制关节炎需要B细胞表达AhR

前期研究表明AhR能够抑制浆母细胞分化，作者假设“补充丁酸盐通过激活B细胞中的AhR直接或间接改变B细胞亚群组成能够抑制关节炎”。根据上述假设，与对照组小鼠相比，从补充丁酸盐小鼠中分离出的AhR激活的原型报告基因Cyp1a1表达显著上调(图3A)。与野生型小鼠相似，补充丁酸盐仅在AhR充足的Mb1^cre/+小鼠中抑制了关节炎的严重程度和CD4⁺IL-17⁺T细胞的频率，而在Ahr^fl/-Mb1^cre/+（具有AhR的B细胞特异性缺失）小鼠中尚未观察到（图3B）。相比Mb1^cre/+小鼠，来自Ahr^fl/-Mb1^cre/+小鼠的B细胞释放的IL-10较少，即使补充丁酸盐也无法缓解IL-10的减少（图3C）。与对照组比较，丁酸盐补充并未改变Mb1^cre/+或Ahr^fl/-Mb1^cre/+小鼠中CD19⁺CD21^hiCD24^hiB细胞的频率和数量 (图3D)。与图2F, 2H结果一致，丁酸盐补充减少了Mb1^cre/+小鼠的CD19⁺CD139⁺ Blimp-1⁺浆母细胞和CD19⁺ CD95⁺ GL7⁺ GC B细胞的频率和数量，却不能抑制Ahr^fl/-Mb1^cre/+小鼠中上述细胞（图3E和3F）。由于炎症是Breg分化和功能的驱动因素，相比Mb1^cre/+小鼠，Ahr^fl/-Mb1^cre/+小鼠出现更严重的关节炎炎症。

补充丁酸盐可维持Breg抑制功能并部分通过AhR依赖性转录控制B细胞分化

丁酸盐是如何维持Breg抑制功能并抑制GC B细胞和浆母细胞的分化？在对照组和补充丁酸盐的Mb1^cre/+小鼠CD19⁺CD21^hiCD24^hiB细胞中，有412个显著差异表达基因(DEGs)(图4A)。与对照组Ahr^fl/-Mb1^cre/+小鼠CD19⁺CD21^hiCD24^hiB细胞相比，丁酸盐补充组有566个显著的DEGs。信号通路分析(SPIA)显示，内质网蛋白加工通路在丁酸盐补充Mb1^cre/+小鼠CD19⁺CD21^hiCD24^hiB细胞中显著下调，在Ahr^fl/-Mb1^cre/+CD19⁺CD21^hiCD24^hiB细胞中显著上调(图4B)。相反，来自Mb1^cre/+小鼠CD19⁺CD21^hiCD24^hiB细胞的负调节因子Id2表达上调，而Ahr^fl/-Mb1^cre/+小鼠补充丁酸后并没有上调(图4C)。与图4C结果一致，在Mb1^cre/+小鼠CD19⁺CD21^hiCD24^hiB细胞中，丁酸盐的添加降低了B细胞淋巴瘤6蛋白（Bcl6）和孤儿G蛋白偶联受体（Gpr183）等位点的B细胞成熟基因的可及性 (图4D)。ATAC-seq分析显示，添加丁酸盐不会改变AhR:ARNT特异性结合基序的可及性，但确实增加了与AHR:ARNT异二聚体(Esrra (雌激素受体α), Creb1, Rarb / Rarg（视黄酸受体））一起作用的转录因子在结合基序上的可及性（图4E）。

为了研究补充丁酸盐后AhR⁺CD19⁺CD21^hiCD24^hiB 细胞和AhR^-CD19⁺CD21^hiCD24^hiB细胞的表观遗传和转录谱变化是否改变它们的稳定性和分化为IL-10感受态Bregs的能力，作者追踪了从补充丁酸盐和对照野生型或整体AhR^-/-同基因CD45.1受体WT小鼠分离而来的过继转移的CD19⁺CD21^hiCD24^hiB细胞命运。与对照WT小鼠相比，从补充丁酸盐的WT小鼠中分离细胞时，转移后回收了更多数量的供体CD45.2⁺CD19⁺CD21^hiCD24^hiB细胞，且更多的被转移细胞为IL-10⁺ (图5A-5D)。当从AhR^-/-小鼠中分离细胞时，丁酸盐补充不会改变细胞的恢复率，且CD45.2⁺CD19⁺CD21^hiCD24^hiB细胞未能分化为IL-10⁺ Bregs（图5A- 5D）。

丁酸盐改变了微生物诱导的AhR配体可用性水平

微生物群是内源性AhR配体的重要贡献者，肠道微生物群组成的变化会改变CD19⁺CD21^hiCD24^hiB细胞向功能抑制性Bregs的分化。作者首先在体外排除了丁酸盐激活AhR的直接作用，并给予广谱抗生素（ABX）处理过的小鼠强饲口服丁酸盐，在ABX处理小鼠中丁酸盐无法抑制关节炎(图6A)。与未处理的对照组相比，从ABX处理小鼠中分离出的B细胞表达的IL-10mRNA更少，且在添加丁酸盐后并无缓解(图6B)，表明共生体微生物对Breg分化很重要，明确丁酸盐抑制关节炎需要共生微生物。作者使用16S rDNA测序比较了空白、对照和丁酸盐补充的关节炎小鼠的粪便中细菌门的相对丰度。补充丁酸盐可引起关节炎小鼠粪便微生物群变化并与空白小鼠菌群更相似（图6C）。相比对照组，补充丁酸的小鼠Allobaculum, Bifidobacterium和未分类的RhoDosprillaceae丰度增加（图6D），其影响色氨酸衍生的代谢物产生，并与AhR激活的配体家族有关。作者检测了对照和添加丁酸盐后小鼠的粪便中色氨酸衍生代谢物，发现与对照组小鼠相比，补充丁酸盐的粪便样品中色氨酸、色胺、吲哚和L-犬尿氨酸的含量没有差异(图6E-6F)。血清素的主要代谢物5-HIAA(图6G)显著升高，犬尿氨酸衍生代谢物犬尿酸 (KYNA)水平显著降低(图6F)。

接下来，作者在体外用5-HIAA和KYNA刺激从小鼠中分离出的WT B细胞，发现不同于KYNA在B细胞中仅诱导Cyp1a1，5-HIAA增加了B细胞中Cyp1a1和IL-10的表达(图7A)。更重要的是，在体内用这些AhR配体处理WT小鼠实验表明，5-HIAA抑制关节炎进展并增加了离体B细胞中Cyp1a1和IL-10的转录(图7B-7C)。为了研究AhR在5-HIAA免疫抑制中的作用，作者给Mb1^cre/+小鼠和Ahr^fl/-Mb1^cre/+小鼠强饲5-HIAA，发现5-HIAA在Mb1^cre/+小鼠中能够抑制关节炎，但不能抑制Ahr^fl/-Mb1^cre/+小鼠关节炎(图7D)。最后，为了探讨5-HIAA在补充丁酸盐后抑制关节炎能力中的作用，作者用色氨酸水解酶（TPH）抑制剂（L-对-氯苯丙氨酸（PCPA），可减少5-HIAA和血清素的生物合成）处理小鼠，发现与对照组小鼠相比，PCPA处理后的小鼠补充丁酸盐失去了抑制关节炎的能力(图7E)。综上可知，补充丁酸盐可增加5-HIAA的产生，它是B细胞中新鉴定的AhR配体，可介导体内补充丁酸盐抑制关节炎的作用。

小结

本研究发现风湿性关节炎患者和关节炎小鼠模型中SCFAs丁酸盐水平下降，补充丁酸盐可通过增加5-羟色胺衍生的主要代谢物5-HIAA直接激活AhR⁺Breg功能和抑制成熟B细胞亚群分化来抑制关节炎小鼠模型的严重程度。5-HIAA是一种新发现的Bregs转录调节因子，它能够激活芳基烃受体AhR，在B细胞中上调AhR依赖的基因和IL-10转录，并且在关节炎中具有免疫调节作用。因此，通过AhR激活来补充丁酸盐可控制Breg功能同时抑制GC B细胞和浆母细胞的分化，可见补充丁酸盐或将是缓解全身性自身免疫性疾病的一种可行疗法。

参考文献

Elizabeth C. Rosser, Claudia Mauri, et al. Microbiota-Derived Metabolites Suppress Arthritis by Amplifying Aryl-Hydrocarbon Receptor Activation in Regulatory B Cells. Cell Metabolism,2020. 31,1–15. https://doi.org/10.1016/j.cmet.2020.03.003.

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