Nature Cell Bology | 天冬酰胺促进T细胞活化和抗肿瘤效应

细胞是免疫系统的关键组成部分，保护宿主免受感染和癌症。而营养物质的可用性（如微环境中丝氨酸、犬尿氨酸和精氨酸能够影响T细胞生存、增殖和效应反应）对于T细胞功能和免疫反应至关重要。尽管代谢改变对T细胞扩增和存活的影响逐渐明了，但对CD8⁺T细胞激活的代谢操纵机制仍知之甚少。天冬酰胺作为一种终端代谢产物会被肿瘤细胞大量释放到胞外。但微环境中天冬酰胺（Asn）对于T细胞功能的影响却知之甚少。清华大学江鹏团队利用饮食中限制或补充Asn、天冬酰胺酶(ASNase)处理以及¹⁵N-Asn同位素示踪技术，揭示Asn在体内外都能显著增强CD8⁺T细胞的激活、增殖和对细菌感染的免疫应答及肿瘤杀伤能力，相关研究成果发表于《NatureCell  Biology》。

Asn促进CD8⁺T细胞活化

作者试图通过测量Asn对CD8⁺T细胞反应的影响来确定它是否影响免疫功能。Asn耗竭导致抗CD3和CD28抗体触发的CD8⁺T细胞活化急剧减少，而添加Asn可以增强CD8⁺T细胞的激活。但CD8⁺T细胞的活性不受Asp的耗尽或添加的影响，这表明Asn在调节CD8⁺T细胞激活中的特定作用。Asn处理导致CD8⁺T细胞数量显著减少，CD62L^lowCD44^highCD8⁺和CD62L^highCD44^highCD8⁺T细胞比例增加。用Asn而非Asp处理可以增加具有干细胞特性的CD8⁺T细胞的数量，表明Asn可以调节CD8⁺T细胞的激活和分化。

Asn补充显著增加CD8⁺T细胞的数量和大小。相反，用ASNase（将Asn水解为Asp和氨的酶）处理细胞去除Asn，逆转Asn对CD8⁺T细胞的作用。当存在Asn时，由B16-OVA黑色素瘤细胞刺激的OT-1小鼠CD8⁺T细胞的激活显著增加；而添加ASNase后，这些效果却完全相反。许多肿瘤细胞产生并分泌大量的Asn，在小鼠EG-7淋巴瘤细胞和人肺癌H1299细胞的培养基中培养的CD8⁺T细胞激活能力显著增强，而补充ASNase则完全逆转了这种作用，表明增加细胞外Asn水平可增强CD8⁺T细胞激活，CD8⁺T细胞对肿瘤细胞分泌的Asn的感知揭示了免疫系统检测肿瘤新生的潜在机制（图1）。

Asn在体内增强CD8⁺T细胞反应

对缺乏Asn基因的小鼠腹腔注射（i.p.）Asn或PBS（对照组），发现与对照组相比，经Asn处理的小鼠血液中Asn水平升高，脾和淋巴结中细胞数量增加。在注射Asn的小鼠中CD25⁺CD8⁺T细胞的数量有所增加。在含Asn饮食的小鼠中，加入ASNase进行Asn剥夺可导致血液中Asn的水平显著降低，脾脏减小，小鼠脾脏和淋巴结中的细胞数量减少。注射ASNase的小鼠中，激活的CD8⁺T细胞数量减少。进一步检测体内T细胞对表达OVA的单核细胞增生李斯特菌（LmOVA）感染的反应。发现限制Asn饮食可以降低OT-1 CD45.2⁺CD8⁺T细胞转移的同基因CD45.1小鼠的脾脏和淋巴结中OT-1 CD8⁺CD45.2⁺T细胞的数量（图2）。总之，Asn在体内影响CD8+T细胞的活性和反应。

Asn促进CD8⁺T细胞活化需要细胞摄取

Asn是增殖细胞中的一种氨基酸交换因子。结果发现，Asn耗竭显著降低CD8⁺T细胞中Ser的摄取，而Asn的摄取不受Ser和Gly消耗的影响。Ser和 Gly缺乏不影响Asn增强的CD8⁺T细胞活化，即使将细胞在无氨基酸培养基中培养，补充Asn仍能改善CD8⁺T细胞活化，提示Asn作为氨基酸交换因子的作用并非促进CD8⁺T细胞活化所必需的。

接下来研究细胞摄取是否对Asn促进CD8⁺T细胞活化至关重要。作者分析了几种潜在的Asn转运蛋白在人淋巴结和脾脏组织中的表达，发现了与Asn交换功能相关的转运蛋白SLC1A5和SLC38A2及三种反转运蛋白（SLC7A1，SLC7A5和SLC1A4）的高表达。沉默SLC1A5而非SLC38A2，能够降低Asn的摄取。且SLC1A5沉默后，Gln的细胞水平显著降低，而Glu却没有显著降低。同样，SLC1A5的药物抑制可显著降低细胞内¹⁵N-Asn和Gln的水平，但不能降低Tyr的水平。因此，Asn和Gln均可使用SLC1A5将其导入细胞。在Gln缺乏的情况下抑制SLC1A5来检测Asn摄取对CD8⁺T细胞激活的影响，SLC1A5抑制足以阻断Asn介导的CD8⁺T细胞活化增强。可见SLC1A5介导的Asn摄取对于Asn促进CD8⁺T细胞活化至关重要（图3）。

Asn增强CD8⁺T细胞激活不依赖于mTORC和Gln

接下来探讨Asn激活T细胞的潜在机制。已报道mTORC1活性的上调在代谢上支持T细胞活化，而Asn能够间接刺激mTORC1的活性。结果表明，CD8⁺T细胞的活化显示mTORC1活性增加，并且这一作用在Asn补充后显著增强。然而，尽管mTORC1抑制剂雷帕霉素可以减少T细胞活化，但Asn诱导的CD8⁺T细胞活化显著升高，表明mTORC1活性的上调虽有助于却不足以促进Asn增强CD8⁺T的细胞活化。

据报道当Gln受到限制时，Asn可用于许多肿瘤细胞的蛋白质合成。同理，在Gln缺乏时，添加Asn可以促进T细胞活化过程中的蛋白质合成，并显著恢复信使RNA的翻译。此外，Gln的耗竭可以降低蛋白酶体抑制诱导的短寿蛋白（MYC和NRF2）的积累，而Asn的补充可以使上述积累明显恢复。因此，Gln的缺乏不足以阻止由Asn介导的T细胞活化的增强，表明背后有独立的活化机制。

LCK介导Asn促进 CD8⁺T细胞的激活和应答

补充Asn改变了多种代谢物的细胞水平，但¹⁵N-Asn同位素示踪实验发现被摄取的天冬酰胺并没有被进一步代谢，表明Asn并非通过代谢直接参与其对T细胞的活化。T细胞活化需要Src家族酪氨酸激酶（LCK）来启动抗原特异性TCR信号传导。当向CD8⁺T细胞提供Asn时，发现激活过程中LCK磷酸化（Y394）、LCK底物ZAP70和PI3K显著增强。在体内也观察到类似结果。OVA肽处理后，转移的CD45.1小鼠在提供Asn时，脾脏OT-1 CD8⁺T细胞中LCK磷酸化显著升高。相反，用ASNase处理后LCK、ZAP70和PI3K的磷酸化降低。此外，使用高分辨成像技术发现，在Asn处理的CD8⁺T细胞中，磷酸化的TCR信号蛋白增加（图4）。总之，这些发现首次揭示了Asn在TCR信号调节中的重要作用。

LCK抑制剂PP2的添加完全阻断了Asn触发的LCK和PI3K磷酸化。PI3K抑制剂GDC-0032轻微影响LCK磷酸化，但降低了Asn培养的细胞中的PI3K磷酸化。与这些发现一致的是，尽管添加Asn增强了CD8⁺T细胞活化，但PP2和GDC-0032的添加却显著逆转了Asn促进T细胞的激活。LCK突变体（Y394F）的引入减少了T淋巴细胞的活化，并削弱了这些细胞对Asn可用性的敏感性。此外，将Asn注射到OT-1过继转移小鼠中，活化的CD8⁺T细胞及效应子增加，而PP2或GDC-0032降低了T细胞和脾OT-I⁺CD8⁺T细胞的数量，从而减少了对照组和Asn处理小鼠之间的差异（图5）。总之，Asn通过LCK增强T细胞活化。

Asn直接与LCK结合并促进其活性

已报道，Tyr505磷酸化使LCK失活，而Tyr394自磷酸化激活LCK。结果发现，Asn剂量依赖性地增加了Tyr394磷酸化且降低了Tyr505磷酸化，并在体外直接激活LCK，而在Asp处理后却并不显著。接下来作者使用放射性氨基酸进行了平衡结合试验，以研究Asn–LCK结合的可能性。将固定在珠子上的纯化的重组LCK蛋白与³H-Asn孵育、洗涤并定量，结果显示LCK以剂量依赖的方式与³H-Asn结合，这可以完全与非放射性的Asn竞争。且³H-Asn仅与LCK结合却不与ZAP70和SLP76蛋白结合。

由于Asn耗竭会降低LCK活性和T细胞活化，因此细胞中Asn的浓度应足以使Asn与LCK结合。起始和活化细胞中的Asn浓度高于LCK对Asn的解离常数（Kd），这可能提示Asn是LCK活性的生理相关调节因子。与此相一致，当向细胞供应Asn时，细胞中Asn的丰度迅速升高，并导致LCK活性和T细胞功能显著增强。相反，ASNase处理后，CD8⁺T细胞中的Asn浓度降低，Kd从高于LCK值下降到低于LCK值。因此，Asn可能通过抑制Tyr505磷酸化来促进Tyr394自磷酸化。为了确定结合区域，比较不同LCK缺失突变体结合Asn的能力，发现Asn的结合位点是在激酶结构域内LCK的240-320位氨基酸之间的区域（图6）。

Asn增强了抗肿瘤T细胞反应

最后探究Asn是否增强抗肿瘤T细胞反应。在限制或补充Asn的培养基中用OVA257-264肽预刺激的起始OT-I CD8⁺T细胞与EG-7或B16-OVA细胞共培养。结果发现Asn赋予OT-I CD8⁺T细胞更高的细胞毒性和杀死肿瘤细胞的能力。当转移到注射了B16-OVA细胞的免疫缺陷小鼠中时，用Asn处理OT-I CD8⁺T细胞，发现肿瘤细胞转移减少且小鼠存活率增加，表现出优异的的抗肿瘤功效。相反，Asn缺乏使OT-ICD8⁺T细胞的抗肿瘤活性降低。

将B16-OVA细胞皮下注射到经PBS或Asn预处理的小鼠中，以评估Asn对内源性抗肿瘤免疫应答的影响。经Asn处理的小鼠表现出较强的抗肿瘤免疫反应，且存活率增加。此外，在免疫耗竭和荷瘤小鼠的腹腔内注射Asn，由OVA引发的OT-1 CD8⁺T细胞也具有有效的抗肿瘤应答。Asn赋予这些肿瘤浸润的T细胞更高的活化能力、细胞因子生成能力甚至增殖能力（图7）。综上表明， Asn水平的升高会增强CD8⁺T细胞的活化及其在体内的抗肿瘤活性。

小结

本研究通过体内体外实验揭示了Asn水平升高可增强CD8⁺ T细胞的活化和对肿瘤细胞的效应功能，限制Asn饮食、给予ASNase酶或Asn转运体SLC1A5的抑制剂可削弱CD8⁺T细胞的活性和反应。Asn不会直接改变细胞的代谢通量，却能与SRC家族蛋白酪氨酸激酶LCK结合并诱导其Tyr394和Tyr505的磷酸化，从而激活LCK信号，进而促进T细胞活化并改善T细胞对病原体或恶性细胞的反应。此外，本研究还揭示了Asn通过控制T细胞的激活和有效性，Asn在直接调节适应性免疫反应中发挥关键作用，LCK是一种天然的Asn传感器，感应Asn介导T细胞功能，为理解微环境中天冬酰胺的功能提供了研究方向。

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参考文献

Asparagine enhances LCK signalling to potentiate CD8⁺ T-cell activation and anti-tumour responses. Nat Cell Biol. 2021. doi: 10.1038/s41556-020-00615-4.

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