Nature Reviews 重磅 | 菌群及代谢物与疾病最全解读
过去20年的研究表明，肠道菌群与人类代谢健康息息相关，肠道菌群异常可能导致多种代谢疾病发生，包括肥胖、2型糖尿病、非酒精性肝病、代谢性心脏病和营养不良等。为了更好的理解肠道菌群影响宿主代谢的机制机理，研究者已从菌群组成分析转向因果研究。高通量多组学数据（包括宏基因组学和代谢组学）的联合分析，以及在人、动物和细胞中进行的生理学和机理实验，可作为相关性结果的分子机制挖掘手段。来自丹麦哥本哈根大学的Oluf Pedersen团队总结了常见代谢疾病相关肠道菌群变化特征，以及菌群代谢产物介导疾病发生发展的潜在机制，并强调了以菌群为导向的干预手段及未来研究转化方向，该成果发表于《Nature Reviews Microbiology》。
菌群-代谢研究手段
目前主要有两种。第一种是全菌群关联研究，通过单纯的菌群16S 测序或宏基因组测序分析，先从疾病组与对照组肠道或粪便中提取并纯化微生物DNA、进行深度测序、组装，其后应用不同生物信息学算法和相关系数，将已组装好的基因聚类为特定的组，从而获得疾病和健康样本中菌群的组成、分类、丰度和功能差异。当然还需要验证样本对此进行验证。第二种是微生物组和代谢组联合分析。肠道菌可以产生各种生物活性代谢产物，这些代谢产物可以通过吸收进入肠肝循环而进入宿主血液循环系统。与疾病表型相关的特定代谢物可以通过基于粪便、血浆、尿液或其他生物体液的质谱或核磁共振代谢组学进行鉴定，从而对微生物组、代谢组和宿主表型进行联合分析，以发现潜在的联系机制。基本可以分为四步：1）基于数据库挖掘菌群基因功能变化；2）代谢物种类分析及功能分析；3）非参数统计检验相关基因和代谢物；4）基于关联分析发现“一个或几个物种或一组物种驱动的假设”，通过“单一变量剔除”交叉验证评估其功能。
菌群因果关系研究思路
1. 疾病组和对照组样本采用鸟枪法测序和非靶向代谢组学分析方法，以获得疾病相关差异菌群或代谢物。其中，在非靶向代谢组学分析中，代谢物的特征在于其保留时间和质荷比（m / z值）。新型化合物可通过核磁共振谱或将碎片信息和保留时间与合成参考标准品比对进行鉴定。
2. 为了确定感兴趣的代谢产物是否以菌群依赖的方式产生，可以使用三重四极杆质谱法对无菌小鼠、抗生素干扰小鼠和对照小鼠样本进行靶向定量代谢组学分析。
3. 将微生物组数据和代谢组数据联合分析，从而获得与特定代谢物产生相关的菌群。通过移植某种菌群后，通过靶向定量代谢组学分析感兴趣的代谢物浓度变化。
4. 为了确定菌群的代谢产物可能参与的下游信号通路，可以构建转基因小鼠模型来观察由于信号通路切断而引起的菌群相关代谢物变化。
菌群干预手段研究
目前菌群干预方式主要有非靶向干预和靶向干预两种。其中，非靶向干预包括：（1）饮食或运动干预。其中，喂养各种营养素组合会改变肠道菌群和新陈代谢，比如饱和脂肪酸、非饱和脂肪酸。此外，体育锻炼会引起肠道菌群的适应性变化从而改变相关代谢物变化发挥其有益作用。（2）试验型益生菌、益生元、后生元干预。（3）异源和自体粪菌移植。由于缺乏菌群定植和存活、供体粪菌处理、供体和受体之间免疫相容性以及噬菌体和真菌对粪菌移植的作用等方面的了解，菌移植是否可以作为预防或治疗代谢功能障碍的手段仍有待研究。靶向干预有两种：即生物工程共生体和药物、噬菌体和基因编辑手段进行特定修饰性干预。给小鼠饲喂大肠杆菌工程菌可诱导饱腹感因子 N-酰基磷脂酰乙醇胺（N- acylphosphatidyl ethanolamine）过表达，进而减轻高脂饮食引起的肥胖和胰岛素抵抗等作用。
代谢疾病与菌群紊乱特征
总体而言，健康肠道菌群通常具有较高微生物多样性、较高微生物基因丰富度及稳定的菌群功能等核心特征。分娩方式和喂养方式塑造了婴儿的肠道菌群，童年时期在环境暴露的过程中逐渐成熟。在儿童期晚期、青春期和成年期很长一段时间内，肠道菌群都处于相对稳定的状态，直到老年时出现多样性降低的现象。此外，在疾病状态下，菌群稳态失调，下面讨论肠道菌群紊乱与肥胖，T2D，代谢性肝病和CMD和婴幼儿营养不良之间的关系。
肥胖与菌群
越来越多的证据表明，除了生活方式、饮食结构等因素，肠道菌群在肥胖发病机制中发挥重要作用。一项双胞胎研究表明，产丁酸菌Oscillospira spp.和产甲烷菌Methanobrevibacter smithii与肥胖抑制相关。另一项针对肥胖个体与瘦型个体的全基因组关联研究表明，肥胖个体中的谷氨酸发酵共生菌Bacteroides thetaiotaomicron丰度明显降低，且与血清谷氨酸浓度呈负相关，而动物模型定植该菌可以抑制肥胖。肠道菌群通路和基因组分析表明，肥胖与单向结合能力降低有关，后者在细菌之间转移基因物质、超氧化物还原酶降低中的作用可能导致肠道氧化应激。将肥胖不一致的双胞胎粪便移植到无菌小鼠，发现其人类供体表型会通过饮食依赖方式传递到受体动物中。这项具有里程碑意义的研究为继续深入研究肠道菌群与全身能量代谢联系起来的肠道微生物信使提供了理论依据。
糖尿病与菌群
流行病学研究表明，与未进行结肠切除术的患者相比，完全结肠切除术的患者发生T2D（2型糖尿病）的风险增加，间接表明肠道菌群和远端肠道的激素分泌能力可能参与了葡萄糖调节。最近的流行病学研究试图阐明肠道菌群与T2D之间的联系，这些研究集中在T2D的药物未干预初期阶段，即糖尿病前期阶段。糖尿病前期个体的血浆葡萄糖值在非糖尿病范围内升高，但此时罹患T2D和缺血性心血管疾病风险会增加。在这些未使用药物的糖尿病前期个体中，肠道菌群表现出产生丁酸盐的菌群类群损失，如 Akkermansia muciniphila丰度下降，以及具有促炎的菌群丰度增加。妊娠晚期妊娠糖尿病（GDM）是另一种糖尿病前期状态。与妊娠三个月血糖正常的孕妇相比， GDM患者肠道菌群组成被破坏，并且在怀孕8个月后的两组妇女中仍可检测到差异肠道菌群。在妊娠期间和之后，GDM肠道菌群与非妊娠T2D个体异常菌群组成相似，如产丁酸的细菌数量减少。在功能水平上， T2D患者肠道菌群中多种通路显著富集，其中包括葡萄糖的吸收相关的膜转运通路；诱导胰岛素抵抗的支链氨基酸（BCAA）向外转运相关通路；与肠道厌氧环境有关的甲烷代谢通路，；促进耐药性的异源物质降解通路；降低胰岛素敏感性复融硫酸盐还原途径（图2）。
心脏代谢性疾病与菌群
一项宏基因组研究表明，发病前或合并症未治疗的情况下，心脏代谢性疾病（CMD）患者粪便肠杆菌（包括大肠杆菌，克雷伯菌和产气肠杆菌）和口腔菌群增加，拟杆菌和消炎菌普拉梭菌丰度减少。在功能水平上，某些发酵相关通路出现降低，磷酸转移酶系统、氨基酸转运体和参与LPS和三甲胺（TMA）合成的酶相关通路出现富集。最近研究表明缺血性心力衰竭与肠道菌群紊乱有关，其中瘤胃球菌、不动杆菌和韦荣氏球菌增加，而另枝菌、粪杆菌和颤杆菌减少。在功能水平上，这些患者的微生物组富含与LPS和三甲胺N-氧化物（TMAO）生物合成相关基因。啮齿动物实验表明，饲喂TMAO或其前体会加速动脉硬化，诱发血小板聚集并增强血栓形成的可能性。此外，用3,3-二甲基-1-丁醇（一种TMA裂解酶抑制剂）抑制肠道细菌TMA的产生可减轻动脉硬化和血栓形成。流行病学研究表明，血浆TMAO浓度与中风和心肌梗死风险增加以及稳定型冠状动脉缺血患者的过早死亡之间存在正相关，这也验证了TMAO可能是动脉硬化的生物标志物。但也有研究发现，喂食富含左旋肉碱的小鼠血浆TMAO浓度增加，但主动脉病变面积却减小，而血浆脂质没有变化，从而表明左旋肉碱在预防动脉粥样硬化方面具有潜在的有益作用，而与血浆TMAO增加无关。
代谢性肝病与菌群
非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）患者中Clostridium, Anaerobacter, Streptococcus,Escherichia和Lactobacillus增加，而Oscillibacter，Flavonifaractor，Odoribacter和Alistipes减少。非酒精性脂肪性肝炎(NASH)患者中，Proteobacteria，Enterobacteriaceae和Escherichia增加。脂肪变性或NASH的儿童患者Oscillospira减少，而Dorea和Ruminococcus 增加。与健康对照组相比，菌群变化与粪便中2-丁酮和4-甲基-2-戊酮升高有关，这些代谢物会导致代谢性肝病患者发生肝细胞毒性。另外，鉴于NALFD患者菌群富含产乙醇菌，诸如大肠杆菌，NAFLD个体的异常肠道菌群比健康对照组产生更多的乙醇，这可以通过循环和呼吸中产生的乙醇浓度增加进行验证。乙醇激活核因子-κB（NF-κB）信号通路，并损害肠屏障功能并导致门静脉内毒素血症而引起组织损伤。NALFD患者肝脏中解毒通路被削弱，提供了恒定的活性氧源，这些潜在活性氧可能对肝细胞造成氧化损伤，进而引起肝脏炎症和脂肪性肝炎。同样，肝硬化患者肠道菌群也发生了显著变化，如Proteobacteria和Fusobacteria phyla增加。与健康人相比，肝硬化和肝衰竭患者肠道菌群的功能显著改变，包括硝酸盐与氨的同化和异化显著富集，这是肝性脑病的标志。除了上述结果外，人和动物的粪菌移植研究表明，肠道中产乙醇肺炎克雷伯菌会加速NAFLD发生发展。此外，针对无糖尿病的肥胖症妇女的多组学研究发现菌群代谢产物苯乙酸可促进肝脏中脂质积累，进而加速NASH。
营养不良与菌群
营养不良是5岁以下儿童死亡的主要原因。母乳喂养、食物安全和水安全是防止营养不良的主要保护因素，也是健康肠道菌群成熟的关键因素，其中菌群成熟的特征是婴儿后期厌氧菌升高之前双歧杆菌短暂的出现丰度增加。早期阶段长双歧杆菌和假双歧杆菌（母乳中的两个关键成员）丧失，代表严重急性营养不良（SAM）的肠道菌群出现最初紊乱。B. longum和B.pseudolongum在塑造婴儿早期肠道菌群方面至关重要，部分原因是广谱羊毛硫抗生素的分泌。之后，SAM异常主要伴随着厌氧菌与兼性厌氧菌比率的异常变化，这可以通过饮食治疗来纠正，进而增加厌氧菌。但是，在营养不良恶化的情况下，成熟的厌氧肠道菌群的丧失会导致能量供应、免疫反应和维生素合成不足，并与慢性吸收不良，腹泻和病原菌的全身性侵袭相关。最近一项采用猪和老鼠模型的研究探讨饮食对断奶后菌群成熟状态的影响，以寻找哪种方式可以促进SAM儿童菌群趋于成熟，并使其代谢和生长状况得到恢复。
代谢物作为菌群信使调节宿主新陈代谢
大量研究表明，肠道菌群分类和功能的破坏与许多病理表型有关。数万亿共生细菌和古细菌是一个巨大的化学工厂，可以合成自身生存和于宿主共存所需的多种代谢产物，进而影响到全身。这些菌群代谢产物和衍生物，可作为菌群的“信使”，影响宿主能量稳态、机体肥胖、葡萄糖耐量、胰岛素敏感性、炎症和内分泌调节等，调控宿主代谢。
SCFA不仅是宿主能量转换的简单底物以及结肠细胞代谢的营养物质，还可通过多种方式影响能量代谢和体内脂肪。丙酸和丁酸都通过刺激厌食激素和瘦素合成而发挥抗肥胖功能。用丁酸盐前体药物（三丁酸甘油酯）可用于治疗饮食引起的肥胖、胰岛素抵抗和肝脂肪变性。丁酸盐还抑制各种组织中的炎症，增强结肠抗炎调节性T细胞的分化，并以G蛋白偶联受体的方式诱导NOD、LRR和含吡啶结构域的蛋白3（NLRP3）炎性小体。另一个G蛋白偶联受体-嗅觉受体78可以调节血压，可以被乙酸盐和丙酸盐直接激活。此外，丁酸的增加会激活过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPARγ），导致肠道内β氧化和耗氧，进而促进维持肠道内腔的厌氧条件。在两项独立的研究中，Anaerostipes hadrus基因组在肌醇分解代谢和3-羟基丁酰辅酶A生成丁酸的代谢模块的结构变异，与体重、腰围和BMI呈反比，表明这些代谢通路与宿主健康代谢之间存在联系。研究发现，长期服用菊粉-丙酸盐可显著降低超重成年人的体重增加、腹腔内脂肪组织分布、肝内脂质含量和胰岛素抵抗。
宿主体内能量稳态和体脂分布也受到胆汁酸的影响，肠道菌群将初级胆汁酸转化为各种次级胆汁酸。这两类胆汁酸通过与各组织内细胞受体结合而发挥其代谢功能，包括核法尼醇X受体（FXR）和TGR5（一种G蛋白偶联受体）。这些受体的信号传导与葡萄糖代谢有关，但两者调控相反，FXR抑制碳水化合物代谢，而TGR5促进碳水化合物代谢。初级胆汁酸中鹅去氧胆酸，是一种高效的FXR配体。次级胆汁酸中石胆酸（LCA）和牛磺胆酸是高效的内源性TGR5配体。肠内分泌L细胞中的TGR5信号传导诱导GLP-1的分泌，从而改善肥胖小鼠肝功能并增强葡萄糖耐量。LCA是一种高亲和力的TGR5激动剂，可通过白色和棕色脂肪组织的褐变来刺激产热，而脱氧胆酸（DCA）和LCA被认为是FXR的拮抗剂。近来，次级胆汁酸的一个亚类，C6-羟基化的次级胆汁酸，引起了人们的注意，这些胆汁酸可能与啮齿类动物的瘦弱和袖状胃切除术后肥胖者的早期体重减轻有关。
几种慢性代谢疾病肠道菌群研究表明，氨基酸代谢功能出现增加。体外和体内研究均表明，吲哚是一种色氨酸经微生物分解的代谢产物，可改善肠上皮屏障功能。吲哚也是一种信号分子，参与增强肠内分泌L细胞肠道激素GLP-1的释放，从而间接影响胰岛素分泌和食欲调节。流行病学研究发现3-吲哚丙酸（IPA，参与色氨酸代谢通路的分解代谢物）浓度与胰岛素分泌和胰岛素敏感性改善相关，降低患T2D发病可能性。
支链氨基酸（BCAAs），即亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸浓度升高是胰岛素抵抗和T2D风险增加的生物标志物。在血糖正常、有胰岛素抵抗的人群中，Prevotella copri和Bacteroides vulgatus丰度增加，导致BCAA合成代谢能力增加；同时Butyrivibrio crossotus和Eubacterium siraeum介导的BCAA摄取和分解代谢能力降低。这些发现在小鼠中获得验证，表明在不健康饮食条件下，肠道菌群可能导致血浆BCAA浓度增加和胰岛素抵抗。在心力衰竭中，BCAA分解代谢受到损害，累积的BCAA会诱导氧化应激并破坏线粒体功能。
丙酸咪唑是另一种损害胰岛素信号的菌群代谢产物。在T2D患者门静脉和外周血中，丙酸咪唑浓度高于健康个体。肠道菌群中的变形链球菌和兰格氏菌，被证实是丙酸咪唑的生产者。在小鼠实验中，丙酸咪唑通过激活雷帕霉素复合物1（mTORC1）通路恶化葡萄糖耐量和胰岛素信号。与这些发现一致，从T2D患者分离的肝组织中发现了mTORC1介导的胰岛素信号传导通路过表达。
宿主和肠道菌群均产生琥珀酸，琥珀酸具有多种作用，其中一种作用与胰岛素敏感性和炎症有关。在野生型小鼠中，菌群代谢的琥珀酸不仅可以预防肥胖症，而且还可以改善胰岛素敏感性和葡萄糖耐量。相比之下，琥珀酸也可能是先天免疫信号的代谢产物。在脂多糖（LPS）激活的巨噬细胞中，琥珀酸可稳定转录因子缺氧诱导因子1α表达，从而增加IL-1β产生引发炎症。因此，琥珀酸在某些情况下可能会诱导炎症导致胰岛素抵抗。
细菌LPS是大多数革兰氏阴性细菌中主要的外表面膜成分。LPS在细菌细胞死亡时释放，并成为宿主免疫力的强大刺激剂。当过量时，例如由于习惯性摄入动物脂肪含量高的饮食或处于极端状态（如败血症引起的内毒素血症），LPS会触发局部和全身性炎症以及胰岛素抵抗。
大肠杆菌分泌的几种蛋白质，包括模拟宿主肽α-黑素细胞刺激激素（α-MSH）的ClpB，都会影响小鼠的食物摄入量和进食方式。从机理上讲，ClpB蛋白刺激肠道GLP-1和PYY的释放，并激活诱导大脑饱腹感通路导致厌食。有研究报告称患有进食障碍（例如神经性厌食症）的患者血浆ClpB水平高于健康人ClpB水平。一些肠道共生细菌带有N-酰基酰胺合酶基因，它们编码的脂质可以模仿经典的真核信号分子与G蛋白偶联受体结合。给小鼠喂食能产生脂质N-酰基丝氨醇的工程菌，该细菌与人源GPR119配体在结构上相似，与对照小鼠相比，该小鼠的葡萄糖耐量得到了改善。MECO-1是一种细菌黑素皮质激素样肽，与α-MSH和促肾上腺皮质激素（ACTH）具有结构相似性，在体外暴露于促炎性刺激环境时，可抑制细胞因子释放，使小鼠免于内毒素的迫害。
小结
本文总结了菌群研究手段、代谢与菌群研究思路以及菌群研究干预手段。强调了肠道菌群组成和功能异常在肥胖、T2D、CMD、代谢性肝病和营养不良中的重要作用，尤其是肠道菌群来源的代谢物及其在肠道菌群和宿主在生理和疾病状态下的信使作用。
针对于菌群相关代谢物，麦特绘谱开发出Q200宏代谢组分析方法，通过构建每一种标准品标准曲线绝对定量检测200+种重要肠道菌群相关代谢物，涵盖短链脂肪酸、中长链脂肪酸、胆汁酸、氨基酸、苯基或苄基衍生物、吲哚、碳水化合物等多种代谢物类群，本文中所涉及的菌群相关代谢物均可定量检测，此外，可以提供代谢组数据与肠道菌群数据关联分析。
参考文献
Yong Fan & Oluf Pedersen. Gut microbiota in human metabolic health and disease. Nature Reviews Microbiology,2020. doi: https://doi.org/10.1038/s41579-020-0433-9
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