Nature Medicine | 肺肿瘤起始细胞依赖蛋氨酸代谢

实体瘤是高度异质的，包含多种肿瘤细胞的瘤内亚群，其中有负责肿瘤发生的肿瘤起始细胞（tumor-initiating cells, TICs）也被称为“癌症干细胞”，因其自我复制和多细胞分化的特性被认为是肿瘤形成的原因。但TICs通常对传统的化疗药具有耐药性，因而容易复发为侵袭性更强的癌症。TICs在功能上不同于非TICs，因此表现出不同的代谢需求。甘氨酸脱羧酶（Glycine decarboxylase，GLDC）是丝氨酸—甘氨酸途径中的一种酶，在肺TICs中过表达，通过重新定向下游代谢过程流量来支持TICs的增殖，但仍不清楚涉及哪些相关代谢物。为了探索其中的代谢变化，新加坡科技局基因组研究所Wai Leong Tam团队采用非靶向代谢组学和同位素示踪技术分析非粘附性肿瘤球（Tumorspheres, TS）和粘附细胞（Adh）、敲低甘氨酸脱羧酶（GLDC KD）细胞间的代谢差异，相关研究成果发表于国际知名期刊《Nature Medicine》。

肺癌TICs的非靶向代谢组学分析

本研究采用源自非小细胞肺癌（NSCLC）富含TIC的LC10和LC32细胞系，经无血清培养后形成非粘附性肿瘤球（TS; TS10和TS32）（图1a）。TS经特殊培养后形成两种同基因细胞系粘附细胞（Adh; Adh10和Adh32）和GLDC KD（GLDC10和GLDC32）细胞株。对这三类细胞进行非靶向代谢组学分析（图1e）观察到三类代谢物的显著变化：（i）核苷酸中间体，源自丝氨酸—甘氨酸和一碳途径的活性，其在TS中高度富集，但GLDC KD中未见富集；（ii）支链和芳香族氨基酸；（iii）与蛋氨酸循环有关的代谢物（图1e）。作者专注于蛋氨酸循环相关代谢物，如蛋氨酸、S-腺苷蛋氨酸（SAM）和S-腺苷同型半胱氨酸（SAH），它们在TS中强烈富集，但蛋氨酸循环对肿瘤起始的作用未见报道（图1f-h）。

蛋氨酸循环由两个主要步骤组成（图1f）。在第一步中，甲硫氨酸腺苷转移酶IIα（MAT2A）消耗甲硫氨酸和ATP产生SAM作为通用甲基供体，SAH作为甲基化反应的副产物。第二步通过SAH水解酶（SAHH）将SAH可逆转化为高半胱氨酸来再生甲硫氨酸。随后通过使用甲基四氢叶酸（CH3-THF）作为甲基供体从高半胱氨酸再合成蛋氨酸，这步由蛋氨酸合成酶（MTR）催化。

蛋氨酸是肺TICs不可缺少的代谢底物

为了评估蛋氨酸循环代谢物在TS中的特殊重要性，将TS饥饿处理48小时后发现蛋氨酸循环活性降低，SAM水平显著下降（~30倍），SAH水平略有下降（图2b），同时组蛋白甲基化整体降低（图2c）。作者进一步评估其体外集落形成能力，并将TS移植到NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ（NSG）小鼠体内，测试其体内致瘤潜能（图2d）。出乎意料地是在体外软琼脂实验中，暂时被剥夺蛋氨酸的TS无法重新形成集落。TS的体内肿瘤形成能力严重下降，肿瘤负荷降低94%（图2d-e）。值得一提的是，TS细胞的短期饥饿（24小时）也足以破坏它们的致瘤潜能，这强调了它们在肿瘤发生过程中对蛋氨酸的绝对依赖。

为了进一步证实肿瘤形成能力受阻是由于蛋氨酸循环活性的丧失，作者尝试通过三种方法来恢复缺乏蛋氨酸的细胞（图 2g-h）。首先，用250 μM高半胱氨酸补充蛋氨酸饥饿培养基，以确定肿瘤细胞是否可以使用高半胱氨酸来再生蛋氨酸。其次，用500 μM SAM补充蛋氨酸饥饿培养基，直接绕过甲基化对蛋氨酸的需求。第三，在功能评估之前，先将TS在完全培养基中恢复48 h。当缺乏蛋氨酸的TS补充SAM或在完全培养基中恢复48 h后，组蛋白甲基化得到修复，蛋氨酸饥饿条件下的集落和肿瘤形成能力得到恢复（图2h）。然而，高半胱氨酸补充剂未能缓解蛋氨酸饥饿的影响，表明TS细胞需要外源性甲硫氨酸用于组蛋白甲基化（图2g）。通过系列试验阐明TICs中肿瘤形成能力的丧失是通过抑制甲硫氨酸循环活性直接介导的。

同位素示踪TICs中蛋氨酸的去路

作者选用能够利用同型半胱氨酸并在蛋氨酸饥饿条件下生长的NIH 3T3细胞作为对照（图3a），利用同位素示踪技术追踪TICs中甲硫氨酸的去向。首先用[¹³C]甲硫氨酸进行短期脉冲追踪实验并通过LC-MS检测和定量。先将TS缺乏蛋氨酸处理16小时，随后添加[¹³C]蛋氨酸并追踪标记代谢物，[¹³C]蛋氨酸及其衍生代谢产物被快速检测到，并在5分钟内达到稳定状态。TS和NIH 3T3细胞中氘标记的同型半胱氨酸和蛋氨酸的丰度在稳态下是相似的，表明同型半胱氨酸导入和蛋氨酸再生的速率是相似的（图3b-c）。与NIH 3T3细胞相反，在TS中未检测到氘代SAM，表明氘代甲硫氨酸衍生的SAM在TS中被快速消耗，这也可以从氘代SAH的产生和TS中更高的甲基化组蛋白水平得以体现（图3c）。因此，TS中SAM的高消耗率导致其对外源性蛋氨酸的依赖。

一碳途径对蛋氨酸循环的重要性

一碳途径提供了甲硫氨酸再生所需的CH3-THF单元，其由MTHFR产生。由于SAM依赖，作者推断MTHFR和MAT2A可能是潜在的治疗靶点。在TS细胞中敲除MAT2A和MTHFR，导致组蛋白甲基化显著减少，软琼脂集落和肿瘤形成能力受损，从而模拟了蛋氨酸饥饿和GLDC KD的表型（图4a,b）。综上数据表明，一碳通路通过MTHFR和同型半胱氨酸的再甲基化作用，对控制CH3-THF单位进入蛋氨酸循环的通量具有关键作用从而防止同型半胱氨酸的积累。CD166（TIC表面标志物）在原发肿瘤细胞中与MAT2A共表达。从人类肿瘤中分离出的CD166⁺细胞也表达了较强的MAT2A，而正常肺组织中相应的细胞表达水平要低得多（图4e）。敲除MAT2A对Adh和NIH 3T3细胞的增殖几乎没有影响，这说明MAT2A在肺肿瘤起始TS中的作用。

蛋氨酸循环的抑制剂影响TICs致瘤性

为了评估蛋氨酸循环是否可作为肺TICs的治疗靶点，作者测试了两种扰乱蛋氨酸循环活性和细胞甲基化水平的抑制剂：（i）MAT2A抑制剂FIDAS-5；（ii）SAHH抑制剂D9，一种DZNep类似物（图5a）。D9的抑制作用导致细胞内SAH的积累（相对于对照细胞增加约30倍）。相比对照细胞，FIDAS-5显著降低细胞内SAM和SAH水平（约为对照细胞的10倍），且对TS蛋氨酸循环活性的抑制作用强于D9（图5b-d）。TS短暂暴露于D9并没有导致组蛋白甲基化水平的显著变化（图5d）；然而，集落和肿瘤形成能力却被部分阻断（图5e）。

TS细胞暂时暴露于D9或FIDAS-5中并不会对其长期增殖能力产生负面影响，也不会引发细胞凋亡，然而长期暴露在FIDAS-5中6天，完全削弱了细胞的生长能力，凸显了抑制MAT2A的治疗潜力。作者推断添加外源SAM可以绕过MAT2A抑制，在FIDAS-5治疗的背景下，给TS细胞补充500μM SAM很大程度上恢复了组蛋白甲基化、集落和肿瘤形成能力（图5d，f）。接下来，作者测试FIDAS-5是否会影响TS细胞在动物体内的致瘤潜能。将TS细胞皮下植入NSG小鼠体内，即刻腹腔注射FIDAS-5（40 mg/kg）或玉米油载体，连续3天。6周后，经FIDAS-5处理的小鼠产生的肿瘤比经载体处理的对照组小（图5）。在原位植入TS并经FIDAS-5治疗的小鼠中发现较少的肺部病变，同样比较FIDAS-5治疗与顺铂（4 mg / kg）（NSCLC肿瘤的前线化疗药物）治疗的效果，发现顺铂不能阻止肿瘤的生长，强调了TICs对化疗的耐药性。用甲硫氨酸循环抑制剂而非化学疗法进行短暂治疗可能足以影响由TICs驱动的肿瘤生长，并强调需要探索使用代谢酶抑制剂作为癌症治疗的一部分。

小结

本研究通过代谢组学和同位素示踪技术对TS及其同基因细胞系的代谢谱进行研究，聚焦于蛋氨酸循环通路相关代谢物的显著性变化，结果表明TICs具有高度增加的蛋氨酸循环活性和由MAT2A驱动的转甲基化率。高蛋氨酸循环活性导致蛋氨酸消耗远远超过其再生，形成对外源性蛋氨酸的依赖。短暂地对甲硫氨酸循环进行药物抑制足以削弱这些细胞的肿瘤起始能力。蛋氨酸循环通量特异性地影响癌细胞的表观遗传状态并驱动肿瘤的发生。蛋氨酸循环酶在其他肿瘤类型中也有丰富的表达，而MAT2A的表达会影响某些癌细胞对治疗抑制的敏感性。蛋氨酸循环底物在TICs中显著富集，通过使用同位素追踪，发现TICs表现出高的蛋氨酸循环通量和对外源蛋氨酸的显著依赖性。针对蛋氨酸循环酶的短暂药物抑制足以导致致瘤潜力的长期丧失。这在很大程度上归因于细胞甲基化的改变，这种改变是由S-腺苷蛋氨酸（SAM）的缺失引起的，而SAM是转甲基反应的基本和普遍底物。本研究结果证实了蛋氨酸循环在肿瘤发生中的限速作用，从而为了解肺癌的代谢易感性提供了新的视角。

参考文献

Zhenxun Wang, Lian Yee Yip,...,Bing Lim, Wai Leong Tam. Methionine is a metabolic dependency of tumor-initiating cells. Nature Medicine (2019). DOI: 10.1038/s41591-019-0423-5

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