Nature | 低亮氨酸饮食改善ER+乳腺癌–他莫昔芬治疗耐药性

美国哈佛医学院贝斯以色列女执事医疗癌症中心Senthil K. Muthuswamy研究团队针对ER⁺乳腺癌患者接受他莫昔芬治疗产生耐药性的机制进行了探讨。

LLGL1和LLGL2是哺乳动物中调节上皮细胞顶端基底极性建立的支架蛋白，与LLGL1不同，LLGL2在ER⁺乳腺癌中过表达，并在营养胁迫下促进细胞增殖。LLGL2与SLC7A5和YKT6（膜融合调节剂）形成三聚体复合物，调控细胞表面亮氨酸转运体SLC7A5水平从而促进亮氨酸的摄取和细胞增殖。乳腺癌细胞对激素治疗的耐药性与SLC7A5和LLGL2依赖的营养应激适应有关。SLC7A5对他莫昔芬治疗产生耐药性是必要的，其被认为是乳腺癌激素治疗耐药性的潜在靶点。本研究中发现， LLGL2在ER⁺乳腺癌中具有促进肿瘤生长而非抑制肿瘤生长的作用，此外，本研究还发现LLGL2对营养胁迫的适应发挥了意想不到的作用。

在雌激素受体和孕激素受体（ER⁺/PR⁺）表达的细胞中，LLGL2水平是其他细胞的3-5倍（图1a, b）。免疫组化分析显示，ER⁺乳腺癌组织中LLGL2表达率为70%（24 / 34），而ER^-乳腺癌组织中LLGL2表达率仅为14% （5 / 34）。在ER⁺/PR⁺乳腺癌患者中，LLGL2 mRNA高表达与较差生存率相关，而在ER^-/PR^-乳腺癌患者中不相关（图1c），可见ER⁺乳腺癌患者中LLGL2的表达与不良预后之间存在着意想不到的关联。在正常培养条件下，MCF-7或T47D乳腺癌细胞株中LLGL1或LLGL2过表达并不影响细胞增殖（图1d）。而在无血清条件下，添加表皮生长因子（EGF）和B27的培养基中，过表达LLGL2可促进贴壁和非贴壁细胞的增殖（图1e）。在10%透析胎牛血清（FBS）培养基中（去除氨基酸和其他低分子营养物，保留生长因子），LLGL2-KD细胞增殖受到抑制，表明敲低LLGL2表达导致了细胞增殖对血清中低分子营养物质的依赖，因此添加B27和EGF的无血清培养基可作为营养胁迫条件。

LLGL2如何促进细胞增殖？通过RNA干扰（RNAi）敲低LLGL2（LLGL2-KD）可抑制MCF-7和T47D细胞在贴壁或非贴壁条件下的增殖（图1f, g），而重新表达LLGL2可恢复增殖。此外，敲低LLGL2并不影响细胞的存活，因此无血清培养基中LLGL2是细胞增殖的调节因子。此外，与MCF-7对照组相比，当细胞被垂直注射到免疫缺陷小鼠的乳腺脂肪垫中时，LLGL2在体内的生长被显著抑制（图1h）。因此，LLGL2在培养基和体内都调控ER⁺细胞的增殖。

为了研究LLGL2如何促进对营养胁迫的适应，通过靶向代谢组学检测LLGL2-KD和对照MCF-7胞内和胞外代谢物的变化，结果显示LLGL2-KD组亮氨酸（leucine）、异亮氨酸（isoleucine）和色氨酸（tryptophan）在培养基和体内肿瘤细胞中均低于对照组（图1i），确定了LLGL2与细胞内必需氨基酸Leu-Ile和Trp水平变化之间的关系。在营养胁迫下，补充过量的Leu能够恢复LLGL2-KD细胞的增殖，说明LLGL2通过促进Leu的摄取来支持细胞增殖（图1j）。过表达LLGL2 （LLGL2- OE）足以促进细胞在LQ（含正常浓度Leu和Gln的十分之一）应激基质中增殖（图1k）；超过10倍的Leu和Gln增强了LLGL2-OE细胞的生长，但对照组细胞的生长并没有增强，从而确定了细胞LLGL2水平与LQ调控的细胞增殖间的定量关系。LLGL2-KD消耗胞外亮氨酸的效率低于亲代或LLGL2-OE细胞（图1l），表明细胞LLGL2的水平影响亮氨酸消耗。在10 x LQ培养基中，LLGL2-OE或LLGL2-KD细胞均表现为胞内Leu增加或显著增加的趋势。

在极化和生理条件下进行近端生物素酰化（BioID）分析鉴定出5种与LLGL2相互作用的溶质载体（SLC）家族蛋白（图2a），结果显示SLC7A5相互作用最强。在ER⁺/PR⁺乳腺癌患者中，高水平的SLC7A5 mRNA与较差的临床预后相关（图2b）。SLC7A5也被称为LAT1 （L型氨基酸转运体），是细胞中主要的亮氨酸转运体，在乳腺癌等多种癌症中均过表达。免疫共沉淀分析显示，在营养胁迫条件下LLGL2与SLC7A5和SLC1A5相互作用（图2c）。SLC7A5和LLGL2共定位在细胞连接处，支持了LLGL2与SLC7A5相互作用促进细胞在营养胁迫下增殖的假说。相比对照MCF-7，敲低LLGL2降低了氨基酸刺激mTOR通路靶蛋白S6激酶磷酸化（图2d），提示LLGL2是ER⁺乳腺癌细胞中氨基酸诱导mTOR活化的调节因子。

在MCF-7或T47D细胞中，敲低SLC7A5（SLC7A5-KD）抑制了细胞在贴壁和非贴壁条件下的增殖，重新表达SLC7A5可恢复细胞增殖（图2e, f）。与对照MCF-7不同的是原位移植的SLC7A5-KD细胞没有形成肿瘤（图2g）。此外，SLC7A5的过表达足以支持细胞在营养胁迫下的增殖（图2i, j），因此SLC7A5是ER⁺肿瘤细胞在培养液和体内增殖的关键调控因子。

虽然在LLGL2-KD细胞中SLC7A5的总蛋白水平没有受到影响，但SLC7A5在细胞连接中丢失（图2k, l）。根据表面蛋白的生物素标记，LLGL2-KD细胞中SLC7A5的细胞表面水平（而不是E-cadherin）明显低于对照组或恢复的细胞（图2m）。乳腺癌组织免疫组化染色证实SLC7A5在LLGL2^high ER⁺肿瘤中膜定位，而在LLGL2^low ER^-肿瘤中膜定位不明确。可见在ER⁺乳腺癌细胞中，SLC7A5定位于细胞连接和细胞膜需要LLGL2。

与LLGL2相比，乳腺癌细胞中SLC7A5的总表达量不随ER状态而变化。使用2-氨基双环-(2,2,1)-庚wan-2-羧酸（BCH）治疗后，ER⁺细胞的生长明显受损，BCH是一种选择性SLC7A5抑制剂，可破坏亮氨酸转运（图2n）。与ER⁺相比，ER^-乳腺癌细胞表面的SLC7A5水平低8倍（图2o）。而在ER细胞中重新表达LLGL2并没有恢复SLC7A5的表面水平，这表明LLGL2与SLC7A5细胞表面水平的关系是特定于ER⁺细胞的。因此，与ER⁺细胞不同，ER^-细胞具有在低水平的Leu和低表面水平的SLC7A5中生长的能力。

尽管LLGL2和SLC7A5及细胞表面SLC7A5之间的相互作用可以在营养充足的条件下检测到，但它们都是由营养胁迫引起的（图3a, b），表明细胞通过增加表面SLC7A5来适应营养胁迫。LLGL2的N端结构域足以与SLC7A5相互作用。值得注意的是，膜定位缺陷的LLGL2-多元突变体（LLGL-Pb）保留了与SLC7A5相互作用的能力，但未能在营养胁迫下恢复LLGL2-KD细胞的生长（图3c,d）。因此，在细胞质中，LLGL2与SLC7A5相互作用，但这种相互作用不足以促进营养胁迫下细胞的增殖。

为了鉴定LLGL2-SLC7A5复合物的其他成员，作者研究了YKT6（一种可溶性NSF附着蛋白受体（SNARE）蛋白）的作用，内源性YKT6与SLC7A5和LLGL2形成三聚体复合物，以适应营养胁迫（图3e, f）。敲低YKT6可抑制营养胁迫下的细胞增殖，降低SLC7A5的表面水平，抑制LLGL2的表达（图3g i）。因此，YKT6是LLGL2-SLC7A5通路的一部分，其调节SLC7A5表面水平和对营养胁迫的适应。本研究结果发现LLGL2与SLC7A5在细胞质中相互作用并将其转运至膜的机制，其中它与YKT6相互作用以促进膜融合并增加细胞表面的SLC7A5水平。

雌激素（E2）刺激MCF-7和T47D细胞诱导LLGL2的表达增加，这与已知的ER信号靶标细胞周期蛋白D1的增加相似（图4a）。作者研究了LLGL2是否为ER靶点，是否参与E2诱导的细胞增殖。对照组和LLGL2-KD细胞在缺乏雌激素活性的培养基中均不能增殖，相比对照组，LLGL2-KD细胞中E2诱导的增殖能力明显受损（图4b），这说明LLGL2是E2诱导的细胞增殖所必需的。E2刺激足以在LQ胁迫条件下恢复细胞增殖，敲低LLGL2可抑制E2在营养胁迫下恢复细胞增殖的能力（图4c），提示E2诱导的细胞增殖依赖于LLGL2。此外，LLGL2过表达增强了E2诱导的细胞增殖，表明LLGL2水平与E2调控的细胞增殖之间存在定量关系。为了检测LLGL2在营养胁迫条件下调控E2诱导增殖的特异性，作者使用CRISPR Cas9基因编辑技术去除LLGL2基因内含子2中的523-bp ERE（ER结合位点）（图4e），E2刺激未能在LLGL2中缺乏ERE位点的细胞中诱导LLGL2的表达，表明内含子2中的ERE是E2诱导的LLGL2表达的关键介质。ERE的缺失消除了E2诱导的细胞增殖（图4g），表明E2介导的对营养胁迫的适应需要表达LLGL2。

在接受他莫昔芬治疗的799例ER⁺乳腺癌患者中，LLGL2或SLC7A5的高表达与生存较差密切相关（图4h），表明LLGL2和SLC7A5可能与他莫西芬耐药有关。抗他莫昔芬（TamR）MCF-7细胞中SLC7A5的总蛋白和细胞表面水平显著上调，而LLGL2的水平无明显变化（图4i, j）。不同于对照细胞，TamR细胞对LQ胁迫不敏感（图4k）。LLGL2的下调降低了SLC7A5的细胞表面水平（图4l, m），LLGL2或SLC7A5的下调也足以恢复他莫昔芬对营养胁迫下TamR细胞的敏感性（图4l, n, p），SLC7A5抑制剂BCH抑制营养胁迫下TamR细胞的生长。值得注意的是，SLC7A5在亲代MCF-7细胞中的过表达足以诱导他莫昔芬耐药（图4q）。因此，LLGL2-SLC7A5是一种以前未被报道的他莫昔芬耐药调控者（图4r）。

小结

本研究发现细胞极性蛋白LLGL2和亮氨酸转运之间存在着意想不到的关联，结果表明LLGL2通过帮助癌细胞战胜营养胁迫，促进了肿瘤生长。E2对营养胁迫的适应和LLGL2氨基酸转运途径的调控促进了他莫西芬的耐药，是针对乳腺癌内分泌治疗耐药性的潜在靶点。

参考文献

Yasuhiro Saito, Lewyn Li, ,Myles Brown& Senthil K. Muthuswamy，et al.  LLGL2 rescues nutrient stress by promoting leucine uptake in ER+ breast cancer[J]. Nature(2019). https://doi.org/10.1038/s41586-019-1126-2.

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