Hepatology | AD/ACLF肝硬化患者“聚焦”色氨酸-犬尿氨酸通路
系统性炎症(SI)参与肝硬化急性失代偿(AD)和急性-慢性肝衰竭(ACLF)的发病进程。在其他疾病中，SI通过犬尿氨酸通路 (KP)激活色氨酸(Trp)降解，产生诱导多器官/系统损伤和免疫抑制的代谢产物。欧洲肝病研究协会慢性肝病研究中心（EASL-CLIF）Joan Clària研究团队对CANONIC研究中1343名因AD而住院的肝硬化患者进行前瞻性观察研究，研究纳入342例AD患者，180例ACLF患者(95例ACLF-1, 65例ACLF-2, 19例ACLF-3)。所有患者(n=522)入组时进行血清KP检测，在28天随访期间的最后一次住院时重复258次测量。对50例ACLF患者进行尿KP测定，另外39例非住院代偿性肝硬化患者(既往无AD史)和40名健康献血者(年龄45-65岁)作为对照进行研究。
基于LC-MS非靶向代谢组学分析血清中Trp和Trp-KYN衍生代谢物，随机选取234例样本(16例健康受试者，20例补偿性肝硬化患者，100例AD患者及98例ACLF患者)进行靶向绝对定量检测。为了探讨ACLF患者中Trp和KYN衍生物肾脏代谢能力，从ACLF患者中随机抽取50例（25例伴有肾功能衰竭，25例无肾功能衰竭）样本，采用LC-MS/MS测定血清和尿液中相关代谢物的绝对浓度。同时以血浆肽素浓度(PCC)和血浆肾素浓度(PRC)作为循环功能生物标志物，分别评价抗利尿激素释放和肾素-血管紧张素系统活性。通过实时PCR检测健康志愿者(n=4)和AD肝硬化患者(n=8)外周血单核细胞(PBMC) RNA中IDO1和IDO2基因表达情况。
KP通路在AD和ACLF患者中被激活
使用非靶向和半定量的HRMS方法评估整个血清代谢组， KP通路四个主要成分(Trp、KYN、KA和QA)浓度水平很高。KYN、KA和QA是与犬尿氨酸通路最相关的代谢物(图1)。测定这些代谢物的血清水平可以提供关于KP通路活性的全面信息，KYN/Trp比值被广泛用于评估TDO和IDO活性。表1A显示健康对照组和代偿性肝硬化患者、AD和ACLF中的血清代谢物水平。代偿性肝硬化患者中，KP通路活性与健康对照组无显著差异，而AD和ACLF患者有较大变化。相对于代偿性肝硬化患者和健康对照，AD和ACLF患者KYN/Trp和血清KYN、KA和QA(表1，图2)更高，而Trp水平较低(表1，图2B)，与TDO或IDO过度活跃导致Trp降解增加和犬尿氨酸产生增加一致。与健康对照相比，AD患者PBMC中IDO1和IDO2的mRNA表达均明显上调(IDO1：6.2± 2.7 vs 0.40± 0.1 a.u), (p < 0.05)；IDO2：1.9± 0.5 vs 0.3± 0.2 a.u, p < 0.03)。有趣的是，ACLF患者Trp水平最低，KYN/Trp，血清KYN、KA、QA水平最高，KA和QA是ACLF患者KP通路活化最敏感的标志物。
KP通路激活与SI强度相关
在整个分析中，炎症介质与血清KA、QA水平之间存在显著但微弱的正相关关系，提示SI、IDO和KP活性过高之间存在关联，其中QA与TNF-α具有最强的相关性(图2C)。
KP通路激活与全身循环功能损害有关
KP活性在患者组中逐渐升高(表1A)，MAP呈平行递进下降，PCC和PRC呈上升趋势，KA、QA水平与PCC有显著的直接相关性，结果表明循环功能损害的强度与KP活性呈正相关。根据肾、脑衰竭或功能障碍程度，对KP活性进行分级。入组时ACLF患者中，肾衰竭患者(ACLF-KF)血清Trp基线水平比无KF患者低，而KYN、KA、QA水平高(表1C，图2A，图2B)。KF患者KP活性过度比存在肾外器官衰竭的ACLF患者更为明显。无KF的ACLF患者的血清KA和QA水平高于AD患者，说明无KF的ACLF患者也与KP活性过度有关，但程度低于伴有KF的ACLF-患者。有趣的是，在AD患者中，肾功能障碍(KD)患者的KP活性高于无肾脑功能障碍的患者(表1D)，说明AD和KD患者的KP活性过度也高于无KD患者。
此外，探讨了在ACLF环境下KP代谢产物的肾代谢能力，检测了25例ACLF- KF患者和25例无KF-ACLF患者的血清肌酐和尿肌酐，血清和尿液中Trp、KYN、KA和QA的绝对浓度及这些代谢物在肾脏的部分排泄 (表2)。KF-ACLF患者血清KYN、KA、QA的绝对浓度较无KF-ACLF患者显著升高。两组患者尿中Trp-KYN代谢物的浓度和排泄分数相似(表2)，但各组患者Trp-KYN代谢物的尿血比值存在明显的异质性。例如，无KF-ACLF患者和ACLF-KF患者的尿血KA浓度比值分别为+472和+88，而QA(+116和+19)和KYN(+3.3和-0.66)的尿血KA浓度比值较低。ACLF-KF患者尿Trp浓度明显低于无KF- ACLF患者。 KP过度活跃与肝性脑病也有密切联系。43例患者中有36例ACLF伴有脑功能衰竭，其KA [1.82 (0.90-4.39) a.u]和QA [67.2 (26.5-156.6) a.u.]水平很高。60例AD和BD患者血清KA和QA水平也高于209例无KD和/或BD患者(表1D)。可见在AD患者和ACLF患者中，KP的激活程度与肾脏和大脑功能的改变及其强度密切相关。AD和ACLF不同病程与KP活性的不同有关。血清KA和QA水平的变化与AD和ACLF患者28天随访的临床病程密切相关(表3)。改善ACLF(ACLF-1 36例，ACLF-2 30例，ACLF-3 3例)和加剧AD或ACLF患者(25例无ACLF, ACLF-1 10例，ACLF-2 11例)均与KA、QA的血清水平变化相关。AD病程稳定患者和ACLF病程稳定患者(22例ACLF-1, 15例ACLF-2, 11例ACLF-3) 在28天随访中的血清KA、QA水平无明显变化。 本研究证明KP在AD患者中被激活，尤其是在ACLF患者中，可能是SI和IDO酶二次激活的结果。作者观察到KP活性与肾脏和脑功能障碍/衰竭、ACLF、全身循环功能障碍、院内细菌感染和死亡率之间的密切联系。Trp-KYN代谢物具有神经毒性、促氧化、免疫抑制、内皮功能障碍和促凋亡等生物学功能，并可能在这些联系中发挥积极作用。因此接下来的研究需要对这些相关性以及针对特定Trp-KYN代谢物进行深入研究探讨，以明确代谢物的具体作用。 ACLF综合征(acute-on-chronic liver failure, ACLF)是肝硬化死亡的主要原因，其特征是全身炎症(SI)和单个或多个器官衰竭。已有证据表明SI和氧化应激可能是肝硬化病变肝脏和肝外器官衰竭之间的共同联系，而SI和氧化应激是其他临床条件下多器官衰竭的众所周知的机制。失代偿肝硬化患者表现为慢性SI综合征，可能与肠道细菌持续移位有关，SI也影响新陈代谢和诱导大量生物活性小分子的变化。ACLF是在沉淀因子(如细菌感染)促进SI进一步增加的背景下形成的。 参考文献 Joan Clària, Richard Moreau, et al, Orchestration of Tryptophan-Kynurenine pathway, acute decompensation and acute-on-chronic liver failure in cirrhosis[J]. Hepatology, 2019.doi: 10.1002/hep.30363
KP活性增加先于ACLF的进展
337例AD患者28天随访期间发生KF的患者（KF- ACLF）KA和QA基线浓度高于无KF-ACLF的患者(表1E，图2D)。在整个研究过程中，与无ACLF的患者相比，无KF的ACLF患者KYN的基线浓度更高(表1，图2D)，研究结果表明KP活性的增加与KF-ACLF的发展有关。
KP活性升高与ACLF相关感染并发症的发生相关
入组时无感染的108例ACLF患者中，有56%患者在28天随访中出现细菌感染，除了血清白蛋白外，现有基线特征数据都不能预测细菌感染的发展。相比之下，几个评估SI强度参数基线在随访期间发生感染的患者比未发生该并发症的患者更高(图3A，表4)。此外，免疫抑制信号即IL-10(图3B)和sMR/sCD206的基线水平显著升高。在各种SI标志物基线评估中，只有IL-10和sMR/sCD206与ACLF患者（入组时“未感染”）随访中细菌感染独立相关(OR(95%CI)：Log (IL-10)，1.35(1.04-1.73)，P=0.022； Log(sMR/sCD206)，2.80 (1.13-6.90)，P=0.026。IL-10和sMR/sCD206预测感染发展的ROC曲线下面积分别为0.695 (95% CI, 0.595-0.796)和0.679 (95% CI, 0.575-0.784)。两种免疫抑制标志物联合[-0.083 + 0.296 ln(IL-10) + 1.028 ln(sMR/sCD206)]显著预测了细菌感染的风险(图3C)。这些结果共同表明ACLF患者存在免疫抑制，可以合理的解释这些患者发生细菌感染的高风险性。由于KP活化可以通过不同的机制引起免疫抑制，比较了ACLF患者和入组时未感染随访期间出现感染的患者KP代谢产物的基线水平，出现感染的患者血清QA基线水平较高(表4)，表明ACLF患者KP活性的增加先于院内细菌感染。
KP过度活跃是肝硬化生存率独立预测因子
基于单变量和多变量分析确定了90天死亡率相关的11个独立基线预测因子（表5）。这些预测因子包括来自临床数据采集的4个变量（年龄较大、胆红素较高、INR较高、血清钠较低）和7个“基准”变量（较高水平的KYN, IL-8, EGF, VEGF和sMR / sCD206，以及较低水平的Trp和INF）。基于单变量分析确定了预测28天ACLF患者死亡率的四个独立参数基线（年龄大、高胆红素、高KYN和高sCD163）(表5)。由此表明KP活性的增加是AD患者和ACLF患者预后不良的主要预测因素。
小结与讨论
本研究首次通过KP通路对大量肝硬化不同阶段患者进行Trp降解的前瞻性研究，探讨Trp降解与疾病严重程度、临床病程和生存的相关性。同时报道了六个重要新发现：代偿性肝硬化患者KP活性正常，但AD患者尤其是ACLF患者KP活性明显升高；研究结果与SI激活KP的结果一致；KP活性和肝硬化的整体严重程度相关；基线KP活性最高的患者在随访期间出现ACLF；免疫抑制和基线KP活性最高的患者，随访期间发生了院内感染；较高基线KP活性可独立预测AD和ACLF患者死亡率。KP活化的特征出现在AD患者中，在ACLF患者中达到顶峰，可能参与ACLF的发病机制、临床发展和死亡率。高KP活性是AD患者(90天)和ACLF患者(28天)死亡的独立预测因子。
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