Nature Communications | 结肠炎通过抑制胆汁酸代谢改善胆汁淤积性肝病

原发性硬化性胆管炎（PSC）是最常见的慢性胆汁淤积性肝病之一；80%的PSC 患者同时患有炎症性肠病(IBD)。PSC常常由于药物疗法收效甚微而发展为肝硬化，终末期的PSC患者唯一选项只有肝移植。既往的研究认为IBD可能会促进PSC的发生和发展。

2023年6月6日，德国亚琛工业大学附属医院的Christian Trautwein和Kai Markus Schneider相关团队在国际知名期刊Nature Communications上正式发表了题为“Colitis ameliorates cholestatic liver disease via suppression of bile acid synthesis”的研究性文章。研究团队认为，PSC和IBD的同时发生表明肠肝器官存在互动。他们首先发现PSC小鼠肠道菌群发生失调；使用IBD-PSC小鼠模型发现结肠炎可以减轻小鼠硬化性胆管炎的肝损伤和纤维化，涉及脂多糖 (LPS) 激活NF-κB、抑制体内外胆汁酸（BA）代谢等相关通路。结合临床结果表明当肝脏疾病伴随额外的肠道炎性疾病时，会更有利于胆汁淤积性肝脏疾病的预后。

1. 急性结肠炎改善Mdr2−/−小鼠肝细胞损伤和胆汁淤积

本研究选择Mdr2敲除动物进行研究。Mdr2基因，也被称为Abcb4，该基因编码一种膜结合磷脂翻转酶，帮助磷脂进入胆汁。Mdr2的缺失会导致胆管内磷脂浓度降低，缺少磷脂的胆汁成分可能会导致胆管受到损伤，胆石沉淀，诱发炎症并进一步导致肝癌的发生。Mdr2敲除小鼠在出生后2-3周，即可出现肝细胞损伤、血管扩张及导管增生的表型，8-9周后，小鼠会出现肝纤维化症状，16个月后，大部分小鼠会发生肝癌病变。

本研究利用DSS（葡聚糖硫酸钠盐）处理WT和Mdr2−/−小鼠7天后引发急性结肠炎，表现为体重减轻、水样或血性腹泻、毛发竖立、运动和食欲下降以及结肠缩短；远端结肠观察到最严重的病变。与对照组相比，DSS组结肠炎评分显著升高，具有上皮屏障破坏、中性粒细胞浸润和杯状细胞丢失，隐窝变形，并伴有带状结构等特征。有意思的是，与Mdr2−/−组动物相比，Mdr2−/−+DSS组中肝细胞损伤标志物（ALT、AST、GLDH）、胆汁淤积（AP）、caspase3活性显著降低；相反地，NF-κB 调节的抗凋亡A1/Bfl-1和cIAP1明显上调。肝脏组织学表明Mdr2−/−+DSS肝脏中的胆道纤维化、有丝分裂活性和胆管增殖保持不变。这些结果表明DSS诱导的急性结肠炎能改善Mdr2−/−小鼠的肝细胞损伤和胆汁淤积。

图1. 急性结肠炎减轻Mdr2−/−小鼠胆汁淤积性肝细胞损伤

2. 结肠炎和肠道屏障损伤引发细菌成分易位和肝脏炎症

免疫荧光染色、qPCR和WB证实DSS显著降低了肠道紧密连接标记物Mucin2 (MUC2)、ZO-1和 Occludin。体内FITC-葡聚糖测定发现，DSS组的FITC-葡聚糖的易位显著增加；此外，DSS组细菌 DNA含量增加——肠道屏障损伤致细菌成分易位增加。组织病理学检查显示Mdr2−/− + DSS 肝脏汇管区中性粒细胞增多；与免疫荧光染色一致：肝脏 Ly6G+和CD11b+细胞计数显著增加。荧光激活细胞分选（FACS）证明了Mdr2−/− +DSS小鼠肝脏中性粒细胞积累。Mdr2−/− +DSS小鼠在蛋白水平表现出IL1β、cleaved caspase1和NLRP3高表达，在mRNA水平表现出Il1β、F4/80、Nos2等基因的过表达。

图2. 结肠炎和肠道屏障损伤引发细菌成分易位和肝脏炎症

3. 结肠炎抑制Mdr2−/−小鼠胆汁酸的合成和运输

肝脏RNA测序结果显示， Mdr2−/−组与Mdr2−/− +DSS组间有近400个显著差异的基因。基因集富集分析（GSEA）显示Mdr2−/−+DSS组的细胞色素P450抑制胆汁分泌、胆固醇代谢、药物或异生物质代谢途径；实时PCR证实了肝脏Cyp7a1和Cyp27a1在Mdr2−/−+DSS组显著减少；Cyp7A1蛋白表达强烈减少。质谱成像（MALDI-MSI）显示，肝脏牛磺胆酸（TCA）在Mdr2−/−显著增加， DSS处理后明显减少；而WT小鼠没有显著改变。上述结果通过HPLC-MS/MS测量血清中胆汁酸进行确证，小鼠静脉血、门静脉血、肝脏和盲肠粪便中的总胆汁酸显著降低，胆汁酸中间体7α-羟基-4-胆汁烯-3-酮（C4）的浓度也显著降低。这些结果表明，DSS 引发的急性结肠炎导致BA合成、摄取和分泌的肝脏转录程序受到显著抑制，从而引发全身BA水平降低。

图3. 结肠炎抑制Mdr2−/−小鼠的胆汁酸合成和转运

4. DSS触发肝脏炎症介导BA代谢

与炎症途径相关的基因、基因集（上皮细胞的细菌侵袭、Toll样受体信号传导、趋化因子信号传导等途径）在Mdr2−/−+DSS肝脏中显著上调。脾脏与体重比增加，表明Mdr2−/−+DSS组动物全身免疫激活和肠道毒素易位。Spearman相关性揭示了炎症基因（Tnf、Il1β、Nlrp3、Tlrs）与BA代谢相关基因（Cyp7a1、Cyp8b1、Cyp27a1、Cyp7b1、Fxr2、Ntcp、Oatp2、Bsep、Mrp2）之间存在负相关。并在已发表的转录组数据中观察到的类似情况，LPS 刺激导致体外系统中胆汁酸转运和合成基因剧烈下调。

LPS注射同样表现出结肠炎样症状。Mdr2-/-+LPS 小鼠表现出胆汁淤积性肝细胞损伤的缓解，伴随血清 AST、ALT 和AP水平显著降低；免疫组化表明 caspase 3主要在小鼠汇管区的免疫细胞中表达；抗凋亡A1/Bfl-1和cIAP1蛋白表达上调；共染色显示TUNEL阳性肝细胞较少。这些结果表明LPS注射会导致免疫细胞明显凋亡，但不会导致肝细胞凋亡。Mdr2-/-+LPS的肝脏中浸润性中性粒细胞数量显著增加，磷酸化NF-κB P65的蛋白表达增加和肝细胞核易位，证明NF-κB激活以及炎症基因（Nfκb、Tnfα、Il1β等）。与之前的DSS模型一致，关键基因Cyp7A1、Cyp8B1和Cyp27A1的mRNA水平、胆汁酸转运蛋白（Ntcp、Oatp2、Bsep、Mrp2和Mrp3）也显著减少。上述结果表明胆汁酸稳态独立于回肠或肝脏FXR信号传导的反馈抑制，由DSS诱导的肝脏炎症引起。

图 4. DSS通过触发肝脏炎症介导BA代谢

5. NF-κB 信号传导缺失加剧Mdr2−/−小鼠的胆汁淤积

相关性分析显示NF-κB和BA代谢基因显著负相关。使用Mdr2−/−NemoΔhepa小鼠模型，发现该小鼠生殖力低，年轻时有严重黄疸、体重减轻，甚至自发死亡，阻止了进一步诱导结肠炎。即使在稳态下，NF-κB 缺乏也会加剧胆汁淤积性肝损伤。流式细胞术显示Mdr2−/−NemoΔhepa肝脏中嗜中性粒细胞积累；H&E、CK19 和天狼星红染色实验结果表明广泛的胆管增殖和纤维化恶化。Mdr2−/−NemoΔhepa小鼠中Cyp7A1蛋白显著上调，NEMO缺失导致肝脏总BA、血清中未结合BA的水平增加。这些发现表明肝细胞 NF-κB限制了Mdr2−/−小鼠的胆汁淤积，并作为结肠炎产生保护作用的中间介质。

图5. NF-κB信号传导缺失加剧Mdr2−/−小鼠的胆汁淤积

6. 慢性结肠炎减轻Mdr2−/−小鼠肝病进展

长期低剂量的DSS喂养，导致Mdr2−/−小鼠表现出结肠炎症状，伴有腹泻、结肠发炎、结肠长度缩短以及较高的脾脏与体重比；血清生化参数（ALT、AST、AP和GLDH）、caspase3显著降低，抗凋亡蛋白（A1/Bfl-1和cIAP1）上调。小鼠胆管间隔纤维化得到改善，并通过天狼星红和胶原蛋白I染色的定量证明。与之一致的是，Mdr2−/−+DSS小鼠中纤维化标记物（ Col1a1、Col1a2、Col3a1）和活化的HSC标记物（Timp1）的表达显著降低。此外，肝脏炎症基因（Icam-1、F4/80、Tlr4、Il1β、Nlrp3、Nfkb、Ccl5、Ifng、Il12a、Il10 ）的表达显著增加，伴随着磷酸化 NF-κB P65 蛋白水平升高和肝细胞核易位。与胆汁酸合成和转运相关的基因（Cyp7a1、Cyp27a1）的mRNA水平、Oatp2、Mrp2）剧烈减少，肝脏 FXR 信号传导（Fxr、Shp）不受影响。这些研究结果表明，慢性结肠炎引发的肝脏炎症通过抑制胆汁酸合成来减少胆汁淤积性肝损伤和胆间隔纤维化。

图6. 慢性结肠炎可减轻Mdr2−/−小鼠的肝脏疾病进程

7. 临床肠道炎症与PSC患者较长的无肝移植生存期相关

研究团队纳入70例临床患者，发现任何节段肠道（回肠末端、升结肠、降结肠或乙状结肠）组织学炎症的存在与肝移植或死亡风险降低存在相关。Kaplan-Meier分析表明组织学炎症的严重程度（分级为无炎症、轻度炎症、中度和重度炎症）与生存估计相关，无炎症组的预后结果更差。

图7. 肠道组织学炎症可改善PSC患者的无肝移植生存期

8. 小结

一直以来结肠炎和屏障功能障碍被证明不利于肝脏和其他器官系统的多种疾病。然而，本研究的IBD-PSC小鼠模型揭示了结肠炎对Mdr2−/−小鼠肝损伤的保护作用。综合运用了多种组学技术（转录组、靶向/空间代谢组、16S rDNA微生物多样性）和传统分子生物学技术，发现结肠炎引发细菌成分易位和肝脏炎症，导致胆汁酸合成和运输受阻；深入研究发现NF-κB信号传导缺失加剧胆汁淤积。而慢性结肠炎引发的肝脏炎症可以通过抑制胆汁酸合成来减少胆汁淤积性肝损伤和胆间隔纤维化；并通过临床案例证实实验室的研究结果。本研究表明的肠道屏障炎症损伤具有肝脏保护作用，为长期存在的IBD-PSC关联提供了新的视角，并为PSC多器官治疗策略的临床研究提供了强有力的实证依据。

参考文献

Colitis ameliorates cholestatic liver disease via suppression of bile acid synthesis. Nature Communications. 2023.

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本研究通过多组学研究发现调控胆汁酸可改善胆汁淤积性肝病。胆汁酸作为一类具有特殊生理作用的小分子，近年来被证实在多种疾病的发生发展中起重要作用。在本研究中，利用胆汁酸分析发现结肠炎抑制了胆汁酸中间体C4的产量，是胆汁酸的合成和运输受阻的重要信号。在确认回肠或肝脏FXR信号传导没有显著差异后，本研究以炎症为切入点深入挖掘其相关机制。针对胆汁酸谱，麦特绘谱拥有两套绝对定量检测方案：胆汁酸基础版和胆汁酸旗舰版，支持胆汁酸与菌群联合分析。

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