上分攻略1 | 蛋白质组学FAQ

随着“人类蛋白质组计划”的提出，越来越多的科研人员将关注力放在蛋白质组学上，蛋白质是生命活动功能的执行者，从蛋白质的角度去研究生命的活动已经成为大生命科学领域研究的重要分支。关于蛋白质组学检测，很多老师、同学有或多或少的疑问，那么小编将大家经常咨询的问题汇总一下，供各位老师、同学参考。

Q2：什么样本能做蛋白组学检测？大概可以测到多少的蛋白种类？

A:原则上只要能提取到蛋白，就可以做蛋白组检测。样本测到的蛋白种类跟数据库和样本本身蛋白浓度有关，一般数据库越大，可以鉴定到的蛋白质数量越多。也与样本的类型有关，通常，组织细胞相比于体液样本，能够鉴定到更多的蛋白。

Q2：蛋白组学样本寄送前是否需要精确计数或是称量？

A:不同样本寄送会有不同的送样要求，按照收集方法提供可以保证实验用量充足。不需要精确计数或是称量，项目开展前会进行蛋白浓度的测定，后续也是不同样本等蛋白量处理、上机检测，但是要保证每个样本的寄样量达到实验要求。

Q3：我的样本不知道有没有降解，量够不够？

A:常规蛋白组检测项目，我们会进行蛋白浓度的测定，确定蛋白量是否够用于后续的检测。同时也会进行SDS-PAGE跑胶查看蛋白是否有降解，条带是否明显，如果蛋白量不够或者胶条有异常，会及时跟客户反馈，沟通解决方法。

Q4：哪些样本需要去除高丰度蛋白？

A:血清、血浆、脑脊液等体液样本，高丰度蛋白比例达到97%~99%，包括白蛋白、免疫球蛋白、IgG、IgA、抗胰蛋白酶、纤维蛋白原、转铁蛋白等。高丰度蛋白的存在会影响低丰度蛋白的检测，而低丰度蛋白往往是比较关注的生物标记物或者药物靶点，常规是建议去除高丰度蛋白再检测。

Q5：胶条样本如何送样检测？

A:可以切关注的部分条带检测，也可以单个样本整个泳道进行检测。如果是整个泳道检测，建议至少分成两份检测，重轻链一份，其他一份，可以增加检测深度。胶条的寄送采用冰袋运输。

Q6：血清血浆样本如何选择？

A:都可以选择使用，血浆含有纤维蛋白原，在血清中检测到的蛋白的丰度相对于血浆来说更高一些，一些比较微量的蛋白可能血清可以检测出。但是血清的操作步骤相对比血浆而言更复杂一些，可能会带来人为误差。

Q7：Label Free/TMT&iTRAQ/DIA产品如何选择？

A:Label free和TMT&ITRAQ属于数据依赖型采集模式（DDA），通常选择TOP N个母离子肽段进行二级碎裂检测，DIA产品属于数据非依赖型的质谱采集方式，全部母离子都可以进入二级破碎，能够定性到的蛋白数量可能会更多，依赖于建库数据；

与标记蛋白组相比，DIA和label free均不会受限于样本数量；与label free技术相比，DIA的可重复性更高。建议样本数量比较大的时候选用此技术。样本数量较小的时候，如果样本之间差异比较大，需要查看蛋白的有无信息，推荐做label free产品。

如果样本例数不多，想进行深度检测，定性定量更准确，建议标记定量产品。

Q8：标记产品最多可以做多少样本？

A:目前标记试剂盒主要分为TMT/iTRAQ两种，试剂盒一次最多可以标记16个样本，如果超过16例，可以通过搭桥样本来实现批次间的校正。

Q9：物种如何选择数据库？

A:常规是使用uniprot网站该物种的蛋白数据库作为搜库文件，如果该物种的数据库比较小或者没有数据库，可以选择以下三种解决方案：（1）扩大物种的层级，选择上一层级或是更大层级的物种库；（2）选择近源物种库；（3）转录组测序结果作为数据库。有些个别的物种有专门的数据库网站也可以采用去进行搜库分析。

Q10:常规定量蛋白组实验的主要步骤有哪些，主要采用哪些仪器检测？数据分析内容包含哪些？

A:实验步骤：首先获得生物学样本，然后进行蛋白提取，定量，SDS-PAGE跑胶质控，还原烷基化，酶解，获得肽段，（标记+分组分），上机检测，搜库软件搜库，数据分析；

仪器：主要采用Q Exactive™ HF-X 、Orbitrap Fusion™、Orbitrap Exploris™ 480等；

数据分析：主要分为基础数据分析、⾼级数据分析和个性化数据分析三个部分。基础分析主要包括差异表达蛋白筛选、层次聚类分析分析、COG注释分析、亚细胞定位分析、GO注释富集分析、KEGG注释分析、PPI分析等。