技术介绍 | iTRAQ/TMT标记定量蛋白质组研究

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iTRAQ/TMT标记定量蛋白质组研究是对一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂混合体系内所有蛋白质进行标记，利用标记试剂中的二级报告离子来对蛋白进行精确鉴定和定量。
标记试剂分为两种：iTRAQ(Isobaric Tag for Relative Absolute Quantitation)和TMT(Tandem Mass Tags)，是分别由美国AB Sciex公司和Thermo公司研发的多肽体外标记定量技术，采用多种同位素的标签，可与氨基（包括氨基酸N端及赖氨酸侧链氨基）反应实现连接，通过高精度质谱分析，同时实现多个样本蛋白组的定性和定量。


1.标记试剂与原理

备注： 
Reporter：报告离子基团，用来对不同肽段进行定量； 
Balance：平衡基团，保证同一肽段标记后母离子质量一致；
Peptide Reactive Group：肽反应基团，与氨基酸N端及赖氨酸侧链氨基反应连接。


2.标记试剂盒种类

3.iTRAQ/TMT技术研究流程

4.生信分析展示

5.技术优势

• 适用范围广：可检测到的蛋白除了胞浆蛋白外，还有线粒体蛋白、膜蛋白和核蛋白。也能对任何类型的蛋白质进行鉴定，包括高分子量，酸性，碱性蛋白质；

• 高通量：一次可以实现多个样品的定性定量分析，特别适用于采用多种处理方式或来自多个处理时间的样本的差异蛋白分析；

• 结果可靠：基于高灵敏度和高分辨的串联质谱方法，定性与定量同步进行，同时得出定性和定量结果，重复样品间的蛋白表达量相关性高；

• 灵敏度高：分级分离，降低样品复杂度，相比凝胶电泳观测到的蛋白变化在2倍以上，iTRAQ计算出的蛋白变化在1.3-1.6倍之间，可检测低丰度蛋白；

• 分离能力强：可分离出酸/碱性蛋白，小于10KDa或大于200KDa的蛋白、难溶性蛋白等；

• 自动化程度高：液质联用，自动化操作，分析速度快，分离效果好。

6.技术参数

• 本要求：

动物及临床组织标本 100 mg/sample
血清、血浆 200μL/sample
细胞 、微生物 1×107 cells/sample
植物嫩叶、嫩芽 500mg/sample
植物种子 200mg/sample
植物果肉 20g/sample

• 储存和运输：

液氮或-80℃保存；足量干冰运输，避免反复冻融。

• 检测平台：

7.应用方向

• 临床生物学及药理学应用方向

生物疾病标志物研究；生物疾病发生发展过程分子机制研究；化学或生物药物作用靶点研究；化学或生物药物作用机理信号转导研究。

• 农林业等应用方向

畜牧业领域：提高肉类品质和饲养条件；农业领域：农作物发育机制的研究；食品科学领域：提高食品安全，改善口感和营养程度的研究；病毒领域：新型病毒抑制因子的挖掘研究。


8.案例分享
应用TMT技术研究由于年龄和高脂饮食引起的小鼠附睾脂肪组织蛋白质组的变化 
Extended Multiplexing of Tandem Mass Tags (TMT) Labeling Reveals Age and High Fat Diet Specific Proteome Changes in Mouse Epididymal Adipose Tissue
研究内容：小鼠附睾脂肪组织的TMT蛋白质组学
发表期刊：Molecular & Cellular Proteomics
影响因子：IF=6.54
研究背景：
肥胖症是一种世界性流行病，与代谢并发症如2型糖尿病、高血压、血脂异常和动脉粥样硬化的发病率增加有关。过去由于缺乏有效的高通量技术手段限制了对附睾组织的整个白色脂肪组织蛋白质组变化的研究。因而作者利用多组高通量TMT标记定量蛋白组技术对小鼠附睾组织的蛋白质组进行了深入的研究。
实验样本：
将20只8周龄的小鼠进行低脂或高脂饮食的喂养，时间为短(8周)或长(18周)(每个实验组5只小鼠)。收集附睾脂肪，溶解，取100mg进行胰蛋白酶消化。用TMT-10plex标记样品和pool样本，合并上机后分为9个馏分。报告离子强度使用内部参考标度(IRS)进行标准化。差异表达的蛋白质通过edgeR的筛选来确定，并通过基因富集和网络分析进行表征。
实验策略：
采用了三组TMT-10-plex试剂盒进行标记。
分析软件：
Proteome Discoverer(1.4.1.14 version,Thermo Scientific), SEQUEST
分析策略：
Volcano plots ,Pearson correlation, Network analysis, Gene Enrichment
研究路线：

生信分析：

6.百趣协助客户发表文献
（可点击标题或图片阅读原文）


1. 通过调节微环境和代谢选择性对抗缺氧肿瘤的高效Pt（IV）前药研究
CAIXplatins: highly potent Pt(IV) prodrugs selectively against hypoxic tumors via microenvironment and metabolism regulation

发表期刊：Angewandte Chemie International Edition
发表时间：2020
影响因子：12.959
作者单位：中山大学
涉及的百趣服务产品：iTRAQ标记定量蛋白组
样本类型：人细胞
主要研究内容：
缺氧和酸性微环境在肿瘤转移和血管生成中起着至关重要的作用，通常会损害化疗效果。作者开发了两种靶向碳酸酐酶IX（CAIX）的铂（IV）前药CAIXplatins，采用iTRAQ蛋白组等实验方法研究了其设计的合理性和功效，结果表明CAIXplatins对CAIX有着很强的亲和力和抑制性，不仅可以克服肿瘤缺氧和酸性微环境的问题，也可以抑制缺氧癌细胞的代谢通路， 而且CAIXplatins的肿瘤选择性是顺铂/奥沙利铂的70~90倍，其全身副作用也得到了有效缓解，因此具有非常广阔的临床应用前景。 
2. 慢性低氧诱导的Cirbp高甲基化会弱化低温状态下的心脏保护作用
Chronic hypoxia–induced Cirbp hypermethylation attenuates hypothermic cardioprotection via down-regulation of ubiquinone biosynthesis

发表期刊：Science Translational Medicine
发表时间：2019
影响因子：16.71
作者单位：中国医学科学院阜外医院
涉及的百趣服务产品：iTRAQ标记定量蛋白组
样本类型：大鼠心脏组织
主要研究内容：
在体外循环（CPB）期间通常使用治疗性低温来保护心脏免于心脏手术中的心肌损伤。而患有慢性缺氧（CH）的患者在心脏手术后具有严重心肌损伤的高风险，但其潜在机制尚不清楚。文章首先利用iTRAQ蛋白质组学研究发现了Cirbp信号轴中的多个重要蛋白，并在此基础上进行深入的分子生物学研究。结果表明CIRBP-COQ6/9-CoQ10轴受损是造成Cirbp-/-大鼠严重心肌损伤和术后心功能不全的原因，而CoQ10补充的心脏停搏液改善CH大鼠的心脏保护作用。这是一项非常具有临床意义的研究，为CH患者提供了个性化心脏保护策略的潜在可能性。
3. 棕榈烯酸在急性前葡萄膜炎中的作用研究
Analysis of the role of palmitoleic acid in acute anterior uveitis

发表期刊：International Immunopharmacology
发表时间：2020
影响因子：3.943
作者单位：重庆医科大学附属第一医院 
涉及的百趣服务产品：GC-MS、TMT标记定量蛋白组
样本类型：人粪便、细胞
主要研究内容：
作为最常见的葡萄膜炎实体，急性前葡萄膜炎（AAU）损害眼睛前段的正常功能和结构，前期研究发现患者与健康人之间粪便中棕榈烯酸（PA）浓度存在显著差异，本文主要使用GC-MS和TMT定量蛋白组等方法在体内体外实验中探讨PA在 AAU发病中的作用，结果表明AAU患者粪便中PA的表达明显增加。PA在临床和实验葡萄膜炎的发病机制中都起着作用。其作用可能是通过改变树突状细胞和CD4+T细胞的功能和分化来介导的。PA在小鼠模型中对树突细胞和CD4+T细胞有免疫调节作用，并减轻疾病的严重程度。 
4. 大肠杆菌中产广谱β-内酰胺酶的潜在机制研究
Proteomics and metabolomics analysis reveal potential mechanism of extended-spectrum blactamase production in Escherichia coli

发表期刊：RSC Advances
发表时间：2020
影响因子：3.119
作者单位：吉林大学
涉及的百趣服务产品：TMT标记定量蛋白组、LC-MS/MS非靶代谢组学
样本类型：大肠杆菌
主要研究内容：
在本研究中，应用TMT蛋白质组学和代谢组学的联合分析来比较β-内酰胺类抗生素敏感大肠杆菌和产超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌（ESBL-EC）菌株之间蛋白质和代谢物的差异，结果表明超广谱β-内酰胺酶的存在影响大肠杆菌的代谢物和蛋白质谱，差异蛋白和差异代谢物可能在ESBL-EC的抗生素耐药性中起重要作用。该研究可以在代谢物和蛋白质水平上为ESBL-EC抗生素耐药性的机制研究提供科学数据，针对这些途径的调节剂可能对ESBL-EC菌株的治疗有效并揭示临床大肠杆菌菌株的抗生素抗性机制。