文献分享 | 基于非靶向的体内微生物代谢谱识别食品基质中的病原菌

发布时间： 2021-05-24 11:10 来源：上海百趣生物医学科技有限公司

发表期刊：Food Research International

影响因子：5.339

平台：SPME/GC × GC- QTOF-MS

研究对象：微生物发酵液、空白发酵液、含菌食品（虾、牛肉、猪肉和牛奶）、空白食品。

1.研究背景

目前，食源性病原菌是影响食品安全的首要因素，建立一种操作方便，有效实用的食源性病原体检测方法显得尤为重要。微生物挥发性有机物（MVOCs）检测已经成为揭示食品中病原菌腐败和污染的一种新颖且有效的手段，但是，MVOCs种类繁多，受微生物种类、生长基质、环境条件等多种因素影响，导致了MVOCs浓度差异巨大。

本文采用的新型的全二维色谱技术和疏水-亲水平衡固相微萃取（SPME）探针技术具有物质分离效果好，捕获代谢物范围广的优点。旨在通过对不同菌种的MVOCs检测，寻找到不同微生物挥发性代谢标志物。从而建立一种食源性致病菌识别新方法。

2.研究思路

3.研究结果

1. 质谱方法优化

本文的适用性验证基于聚合物复合萃取探针，将该探针与三个商用萃取探针相比较，包括DVB /CAR/ PDMS(50/30μm), PDMS / DVB(65μm)和PDMS(75μm)。从提取的Shigella sonnei MVOCs的总峰面积来看1-1，新型SPME探针具有较大的峰面积，提取效果最好。结合定性比较结果，PDMS或CAR/PDMS对双极性化合物(如醇和酮)的灵敏度较低。与DVB/CAR/ PDMS相比，新型SPME探针具有更高的保留能力，更适合于提取不同理化性质的MVOCs。因此，新型的SPME探针有助于提供更全面的MVOCs谱，为我们后续的实验提供了有力的工具。考察了气相炉升温速率和萃取时间对萃取效果的影响。优化结果如图1-2，1-3所示。在初始温度不变的条件下，以5℃ /min的加热速率从50 ℃~ 230℃，对MVOCs的检测灵敏度优于其他加热方案。同样，为了获得更好的提取效果，根据图1-3中总峰面积随提取时间的延长而增加的结果，选择60 min作为最佳条件。

2. MVOCs的鉴定与分析

优化后，将所建立的方法应用于5种食源性致病菌体内挥发性代谢产物的检测，共鉴定出126种MVOCs为与细菌生长和代谢活性相关的优势代谢产物。图2-C为五种食源性致病菌的MVOCs的PCA分析，显示了它们之间响应性代谢特征的分离，并初步评价了实验的重复性。不同菌株间鉴定的代谢物的主要化学类别如图2-A所示。主要的基团是酯类、烃类、醇类、酮类，其次是吡嗪类。在伤寒沙门氏菌(55.56%)、金黄色葡萄球菌(26.32%)和大肠杆菌(24%)中检出大量碳氢化合物。副溶血性弧菌中烃类含量较低(3.57%)。其中，桑内志贺氏菌(34.38%)和金黄色葡萄球菌(26.32%)的酯类含量特别高。酮和醇的比例相近，吡嗪的含量低于其他四种。图2B为五种致病菌独有和共享的挥发物的维恩图。具体来说，所有被研究的细菌都共用十二烷。2,4-二叔丁基苯酚和2-乙基己醇由副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌共同拥有。此外，副溶血性弧菌与鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌共有2-十五烷酮、邻苯二甲酸二异丁酯和邻苯二甲酸二丁酯，与松内志贺氏菌和大肠杆菌共享1-辛醇和1-癸醇。金黄色葡萄球菌、志贺菌和大肠杆菌共享十八烷，前两种菌共有2,5-二甲基-3-异戊基吡嗪和2-戊基呋喃，后两种菌共有苯乙酮和3-苯基呋喃。痢疾志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌与十一烷共有，而桑氏志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌与2,6-二乙基吡嗪共有。大肠杆菌与溶血性弧菌、鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌分别共有吲哚、环戊烷酮和2,5-二甲基吡嗪。副溶血性弧菌分别与鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌共有(z)-6-pentadecen-1-ol和二甲基三硫。

3. 微生物的代谢生物标志物图谱

微生物的挥发性代谢产物深受培养基的影响，因此进一步分离和分析培养基与微生物之间的差异，对于寻找微生物独特的代谢标志物具有重要意义。分别构建了5个OPLS-DA模型来区分5个研究纯菌株及其无菌培养基的代谢产物谱。结果如图3所示。然后用VIP值超过1作为卡值标准，结果如图4所示。不考虑培养基的影响，多变量筛选得到22个差异代谢物。为了进一步明确有效的生物标记。在图5中考虑了纯培养基与菌株峰面积的比较。与无菌培养基相比，吲哚、2-十一烷、降植烷、2-己基呋喃、1-壬醇、丁基羟基甲苯、1-癸醇、3-甲基丁酸、2-十二烷酮、甲基-2,4-癸烯酸甲酯和2-十四烷酮的峰面积显著增加。说明上述物质是菌株自身代谢的优势化合物。结合前人研究，五种食源性致病菌的潜在挥发性代谢标志物如下1-壬醇(志贺菌)、丁基羟基甲苯(志贺菌)、2-己基呋喃(志贺菌)、降植烷(鼠伤寒杆菌)、1-癸醇(大肠杆菌)、甲基-2,4-癸烯酸甲酯(金黄色葡萄球菌)、2-十二烷酮(金黄色葡萄球菌)、3-甲基丁酸(金黄色葡萄球菌)、以及2-十四酮(金黄色葡萄球菌)。吲哚是大肠杆菌和副溶血性弧菌共同拥有的潜在的挥发性标记物。

4. 食品中五种致病菌潜在挥发性标记物的检测

食物基质可能不同于肉汤培养系统。因此，通过实际食品样本验证新型SPME探针在病原细菌识别中发现的潜在挥发性标记物，以支持所建立方法的实用性。根据细菌宿主的实际情况，对虾、牛肉、猪肉和牛奶三种食物基质进行了调查。分别测定了各细菌在相应的食物基质和培养基上生长的潜在挥发性标记物的峰面积，其产率随时间的变化曲线如图6所示。受污染的食品样本中金黄色葡萄球菌的3-甲基丁酸和2-十一烷酮、大肠杆菌的吲哚和1-癸醇、副溶血性弧菌的吲哚和2-十一烷酮的信号强度先升高后降低。鼠伤寒沙门氏菌的降植烷和金黄色葡萄球菌的甲基-2,4-癸烯酸甲酯以及2-十四烷酮的信号强度逐渐升高。食物中致病菌代谢标志物浓度的变化与细菌在培养基中的生长趋势一致。另外，上述化合物均未在实际样品的对照组中检测到。结果表明，食物基质中的微生物利用食物中丰富的营养物质进行自身生长繁殖，并继续产生自己独特的代谢产物。

4.结论

本研究成功地将新型SPME探针与GC×GC-Q-TOF-MS相结合，应用于五种食源性致病菌体内挥发性代谢物的检测。通过多元统计分析，筛选出11个潜在的挥发性标记物，并在特定的食品基质中进行了验证

本研究结果突出了体内挥发性代谢物作为食源性致病菌生长和代谢状态指标的适用性，为微生物代谢组学的研究提供参考，该方法可为微生物识别提供一种简单、高效、灵敏的替代方法。

文献原文下载链接：

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提取码：ds17

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