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代谢组学揭示肥料和农药混合使用可提高黄瓜果实品质，促进农药在果实中的消散

文章标题：Metabolomics analysis of cucumber fruit in response to foliar fertilizer and  pesticides using UHPLC-Q-Orbitrap-HRMS

发表期刊：Food Chemistry

发表时间：2021年8月

影响因子：7.514

合作客户：中国农业大学

百趣生物提供服务：非靶标代谢组学

研究背景

黄瓜(Cucumis sativus L.)被认为是最健康的蔬菜之一，因为它为人体提供各种营养，如葫芦素、木脂素和黄酮类化合物。黄瓜产量高，经济效益好，在我国大棚中广泛种植。由于温室栽培黄瓜具有高温、高湿、通风不良、土壤更新困难等特点，而黄瓜根系本身对土壤环境敏感，导致温室栽培黄瓜面临虫害、营养不良等诸多问题，农药和化肥常用于提高黄瓜产量和品质。

但由于代谢物的高度复杂性和设备的限制，研究这种混合施用对黄瓜代谢的影响受到限制。

本文采用配备有加热电喷雾电离（HESI）源的超高效液相色谱-四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱分析黄瓜果实中的代谢物谱。结合代谢组学和表型研究结果，建立了生化网络，为黄瓜果实在农药和叶面肥混合使用下的代谢途径提供了机制分析。

结果和讨论

黄瓜果实有机酸的针对性分析

有机酸是水果和蔬菜中的天然化合物。作为水果风味和营养物质的重要组成部分，水果中有机酸的含量和种类是决定水果品质的重要指标之一。在试验过程中，分析了不同处理对黄瓜果实有机酸的影响。由图1 (a-e)可以看出，不同处理，特别是T3处理(吡蚜酮、戊唑醇和叶面肥)黄瓜果实中有机酸含量均高于CK处理，在7d时差异达到了统计学意义。
酒石酸是黄瓜果实中所含的一种独特成分，具有抑制人体糖向脂肪转化的作用，被认为是一种天然的减肥食品。抗坏血酸(AsA)(维生素C)是一种众所周知的抗氧化剂，具有解毒、抗癌和清除自由基的作用。叶面肥配合农药的施用可显著提高黄瓜果实中酒石酸和AsA的含量,表明混合使用肥料和杀虫剂不能仅仅提高营养价值,也更好地抑制糖转换成脂肪在人体内。

黄瓜果实抗氧化能力的针对分析

GST、POD、AsA、GSH在植物的解毒过程中发挥重要作用。图1 (e-h)显示，在0.17 d时，不同处理对植物的抗氧化能力有较大影响在0.17 d时，结果表明黄瓜果实能快速激活抗氧化系统以缓解外界胁迫。黄瓜果实抗氧化能力受农药(T1和T2)的影响而增强，在叶面肥中添加农药(T3)进一步增强，这与农药快速消散一致。

在农药(毒死蜱、乐果、狄氏剂)与肥料的混合使用中，抗氧化酶得到了增强，因为肥料中的微量元素提高了抗氧化酶的浓度，减少了农药造成的抗氧化损伤。因此叶面肥和农药的混合施用可显著提高黄瓜果实的抗氧化活性，有利于促进农药的消散。

图1.不同处理对黄瓜果实有机酸含量及抗氧化能力的影响 T1:单独使用吡蚜酮；T2:吡蚜酮与戊唑醇合用；T3:吡蚜酮与戊唑醇、叶面肥配合使用。用不同字母(a, b, c)标记的条表示差异显著(p < 0.05)。

不同处理对黄瓜果实整体代谢谱的影响

利用UHPLC/ESI-Q-Orbitrap HRMS代谢组学方法获得黄瓜果实的代谢产物谱。

从图2的火山图可以看出，与其他处理相比，T3处理的样品大部分都是上调的。与T2相比，T3处理下上调化合物在总差异化合物中所占比例接近100%，说明叶面肥的添加对农药胁迫下黄瓜果实的代谢具有显著影响。与T1相比，T2处理下下调的化合物在总差异化合物中所占比例接近100%，说明联合施用农药和单独施用农药显著改变了黄瓜果实代谢。

图2.不同组别的差异代谢物火山图

图3-1.黄瓜果实代谢谱数据的PCA评分图 T1:单独使用吡蚜酮；T2:吡蚜酮与戊唑醇合用；T3:吡蚜酮与戊唑醇、叶面肥配合使用；QC:质量控制。

图3-2.不同处理的OPLS-DA评分图 T1:单独使用吡蚜酮；T2:吡蚜酮与戊唑醇合用；T3:吡蚜酮与戊唑醇、叶面肥配合使用。

注：图3-1和图3-2Pca和oplsda结果表明组间区分效果非常好。

综合实验结果揭示不同处理下黄瓜果实的代谢反应

1.不同处理对黄瓜果实代谢途径的响应

生理变化是代谢变化的结果，代谢物丰度的变化反映了特定代谢途径的抑制或激活，这也代表了代谢重排。将所有实验结果整合到MetaboAnalyst分析生物通路。结果表明，鉴定的化合物涉及36个代谢途径。本研究共构建了12条代谢途径，包括氨酰- trna生物合成途径；酪氨酸代谢；三羧酸循环；精氨酸和脯氨酸代谢；异喹啉生物碱生物合成；甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸的代谢；苯丙氨酸代谢；半胱氨酸和蛋氨酸代谢；丙酮酸代谢；丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代谢；淀粉和蔗糖代谢；色氨酸代谢。

图4.中枢代谢生物合成途径的代谢产物网络变化

图4较为完整地展示了中枢代谢生物合成途径的代谢产物网络变化，包括糖酵解、TCA循环、氨基酸代谢和抗氧化系统代谢。虽然糖酵解相关的中间体没有变化，但不同处理下的净光合速率的增加表明糖酵解途径被激活。此外，三羧酸循环中间体(柠檬酸和l -苹果酸)的丰度上调，表明三羧酸循环发生了上调。糖酵解和三羧酸循环是能量相关的途径。这两个途径的上调表明，混合农药处理后，黄瓜果实产生更多的能量，尤其是叶面肥处理。同时，脂肪酸含量显著降低，说明糖酵解和三羧酸循环产生的能量没有积累，而是被消耗以维持正常的生理过程和/或增加防御相关活动。

2.不同处理对黄瓜果实氨基酸代谢的影响

不同处理下氨基酸含量的变化表明了黄瓜果实氮素代谢的重塑(图5)。在本研究中，与两种农药（T2）的混合使用相比，添加氨基酸叶面肥（T3）实际上降低了5天时的氨基酸含量，表明叶面肥和农药的混合使用可能会改变黄瓜果实中低分子量氮源的组成。然而，由于这个实验只涉及黄瓜果实中的氨基酸的变化在5天，和氨基酸在黄瓜果实不断合成和代谢，有必要对氨基酸进行动态监测，进一步研究了黄瓜果实中氨基酸转换的潜在机制。

图5.不同处理黄瓜果实中氨基酸的相对丰度

除丝氨酸外，其余脂肪氨基酸(缬氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、精氨酸和谷氨酰胺)均有相同的响应趋势：T1处理黄瓜果实中上述氨基酸含量普遍高于对照，T2处理和T3处理均降低了上述氨基酸含量。结果表明，吡蚜酮单独施用和吡蚜酮与戊唑醇混合施用对黄瓜果实中部分脂肪族氨基酸含量的影响完全不同。

不同处理黄瓜果实中丝氨酸、色氨酸、组氨酸和脯氨酸含量均低于对照。生理结果表明，不同处理对植物生长有积极作用，即增加有机酸含量，促进光合作用。然而，不同处理对生长素生物合成的重要前体色氨酸含量没有显著影响。以往的研究报道，脯氨酸在许多植物中都是在环境胁迫下积累的，而脯氨酸的上调可以消除活性氧(ROS)，抑制脂质过氧化，有助于植物适应各种环境胁迫。这与本试验中脯氨酸含量的降低不一致。一些研究人员发现，在盐胁迫下，菌根植物的脯氨酸浓度低于非菌根植物，这可能是由于菌根植物的耐盐性更高，以及其他耐盐机制的增强。

本试验中，黄瓜果实脯氨酸含量在5d时的降低可能与其他相关抗氧化能力的提高有关。此外，还与农药胁迫的减少有关，即农药造成的危害减少。芳香族氨基酸(苯丙氨酸和酪氨酸)参与莽草-苯丙氨酸途径。与对照相比，T1和T2处理中芳香氨基酸含量增加，T3处理降低。莽草酸-苯基丙酸途径可产生多种抗氧化剂(如类黄酮和酚类)及其前体(如芳香族氨基酸)，以清除或抑制农药胁迫下植物细胞中ROS（活性氧）的合成。

结 论

采用非靶向代谢组学和生理分析方法，研究了吡蚜酮、戊唑醇和叶面肥对黄瓜植株生长和果实代谢的影响。结果表明与单独施用农药或两种农药混合施用相比，叶面肥与农药混合施用可提高叶绿素和氮含量，促进植物光合作用，从而调节黄瓜果实中相关代谢产物和代谢途径，提高了黄瓜果实的品质和抗氧化能力，促进了农药的消散。因此，叶面肥与农药的混合施用是提高黄瓜果实品质、促进农药在果实中消散的有效策略。

文/阿趣代谢组学