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干货丨2分钟带您玩转样品前处理仪器-GPC

发布时间: 2020-12-22 10:01 来源:上海安谱实验科技股份有限公司

体积排阻色谱SEC在样品前处理中,有着独特的作用,今天小编就带您一起探寻一下GPC的原理,以及它在样品前处理中的出色应用,一起来学习吧!


1.定义

体积排阻色谱法(Size exclusion chromatography,SEC)是利用多孔凝胶固定相的独特特性,而产生的一种主要依据分子尺寸大小的差异来进行分离的方法,它又称为空间排阻色谱法(Steric exclusion chromatography)。


2.分类

流动相:水;凝胶过滤色谱(GFC)

流动相:有机相; 凝胶渗透色谱(GPC)


3.固定相

填料:多孔凝胶(软性凝胶和刚性凝胶);

特点1:表面分布大小不一的小孔(如图)

特点2:凝胶颗粒间存在空隙

001.png

4.分离

特点1:

化合物按照分子量大小,分为小分子,中等分子、大分子。

小分子: 能通过小孔、中孔、大孔、空隙;

中等分子:能通过中孔、大孔、空隙;

大分子: 被排阻在外,只能通过填料空隙。


特点2:

分子量越小,越能通过更多不同的孔径的孔,分子量越大,只能通过一些较大孔径的孔,分子量足够大完全被排斥在外,而不能通过孔,只能通过填料间的空隙。


特点3:

能通过的孔越多,所走的距离越长,出峰越慢;能通过的孔越少,所走的距离越短出峰越快。

1.jpg

5.原理

基于分配理论:

001.png

6.确定分子量大小

如同色谱质谱的定量分析一样,通过标准曲线法来定量未知样品的分析物质的浓度。在GPC中组分从柱中的洗脱体积(Ve)与分子量(M)存在对应关系lgM- Ve,我们可先通过配置好的已知分子量的化合物分子,进样后,在凝胶柱上存在对应的洗脱体积,来配制标准曲线,在相同色谱条件下,未知的物的分子量,可以通过其洗脱体积,在准曲线上找到对应的分子量。

001.png

A: 分子量为106, 对应洗脱体积为V0

B:分子量为103 , 对应洗脱体积为V0+VP

X: 未知物,对应的洗脱体积为Vx, 可求得其分子量大小


7.两个极限

极限一:排阻极限

如果要分离的物质,分子量足够大,比填料的最大孔径都大,所有分子都将被排斥。


极限二:渗透极限

如果要分离的物质,分子量足够小,比填料的最小孔径都小,所有分子都被渗透。


结论:体积排阻色谱只能分离凝胶柱处于渗透极限对应化合物分子量A和处于排阻极限对应化合物分子量B之间的物质。


8.举个例子(土壤中的多环芳烃的分离)

001.png

图中的蓝色为为土壤萃取物的紫外吸收曲线,可以发现,色谱峰型较宽,只出现一个混杂的色谱峰,如不处理,将难以进行定量分析,黑色线为经过SEC处理的土壤提取物,当得知多环芳烃流出的时间后(收集点),在其流出时间处收集(红色部位),将收集物在反相液相色谱上分析,得到如下色谱图:

001.png

经过SEC处理的收集物(多环芳烃),在HPLC上 得到了好的分离,干扰性杂质(玉米油、DEHP等)也得到了很好的去除效果。另外GPC得一个典型的应用,就是在农药残留分析中,去除油脂,大分子蛋白、色素。SEC提供了常规SPE和LLE难以分离处理的复杂基质样品的前处理手段。


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