干货丨且看如何利用梯度洗脱方法一招破解出峰问题--原理篇

我们先来看一张图

通过一张直观的图来探讨今天的话题

这三张色谱图的条件如下：

测试物质为C1-C10的烷基胺同系列衍生的衍生的亚奈基苯并咪唑胺黄酰

这三张色谱图给您的直观感觉是什么？

●A图等度洗脱，95：5的甲醇水，10个峰在10min出峰，峰很尖锐（窄），可是基线不分离。

●B图等度洗脱，80：20的甲醇水，10个峰在50min出峰，后面的峰明显展宽，峰矮胖。

●C图梯度洗脱，所有物质在20min出峰，分离度和响应都良好。

这三张图看完后，您是否有如下疑问？

●等度洗脱，要么几个峰分不开，要么分开了，时间长，出现矮胖峰，等度洗脱不适合多组分分离嘛，同行告诉我多组分一般要使用梯度洗脱，这是为什么？

●梯度洗脱是怎么实现化合物在好的分离度下，又保持色谱峰不展宽，出现尖锐的色谱峰的？

●怎么设置梯度，怎么确定一个好的梯度洗脱方法？

为了解决大家的困惑，

我们今天就是要来探讨，

为什么多组分要使用梯度法，

梯度洗脱怎么优化。

对于多组分的检测，我们希望什么？

1、良好的分离度

2、好的响应，峰高和峰面积，色谱不展宽，得到窄的色谱峰。

首先，我们来看看影响色谱分离度的因素是什么？

这里给大家放上一个分离度的关系式：

式子中的R为分离度，k为容量因子，a为分离因子。

我们来回顾一下基本知识：

t_M 为不被固定相保留的死时间，

t_R为化合物的保留时间（从进样到出现浓度最大值的时间），

t_R^’为化合物的调整保留时间。

容量因子：是化合物在液-固两相达到分配平衡时，组分在固定相与流动相中的质量比值，因此又被称为质量分配系数。

分离因子：分离因子是在同一色谱系统条件下保留的差异的量度

当α=1时，两个色谱峰具有相同的保留时间并共流出。

对于多组分，我们需的是，在一定的时间内将组分分离，并且得到一定的色谱宽度的峰（尖峰）；那么想要良好的分离度，需要的是相邻的两个化合物能达到基线分离，首先看一下分离度公式，看看什么影响分离度：

其中：；我们可以看到，在同一色谱系统，两个化合物的分离因子，与此色谱系统下，化合物自身特性相关，当α越大，分离度也将越大。

而其中：

可见，K’增大，可以提高分离度。

我们知道，梯度洗脱程序在改变流动相的比例，以达到分离的目的，那么梯度洗脱究竟是怎么来影响分离度的呢？

我们以反相色谱系统为例，来看一下，当我们改变了流动相比例时，k’的变化情况。

这是一张反相色谱图中，化合物的lgk’与流动相中有机相比例的关系图，近似为线性的关系图。从这张图，可以看出，在反相色谱中，lgk’随着ψ比例增大，逐渐降低，k’也逐渐减小。

即:  lgk’ =Aψ+B (A为曲线的斜率，B为截距）。

通过这张图，我们来说明为什么需要梯度洗脱，

对于化合物1，2

Ψ=0.45时，lgk1’ =0.97，k1’=9.33；

lgk2’=1.27,   k2’=18.6;

如果我们使用等度洗脱，有机相的比率为45%，我们会发现，由于此时的k1’=9.33， k2’=18.6，k’都大于10，这个时候，化合物与固定相作用的时间较长，因此可以想象，在这个时候化合物1，和化合物2 出峰时间都比较靠后，而且由于强的作用力，导致流动相无法在一个短的时间内将化合物洗脱出来，因此峰都变得比较矮胖，也就是宽峰，如图：

对于化合物1，2

Ψ=0.65时，lgk1’ =-0.21，k1’=0.61；

lgk2’=-0.35,   k2’=0.44;

如果我们使用等度洗脱，有机相的比率为65%，我们会发现，由于此时的k1’=0.61， k2’=0.44，k’都接近于0，此时化合物会被流动相快速带出，形成尖峰，但由于两个化合物得K'都很小，而且接近，会形成共流出物，而且，第一个峰出峰时间最 好大于2t_M（K’=0)值，反映得图如下：

那么如果是梯度洗脱，会怎么样呢：

在梯度洗脱过程中，K’的值会随流动相的变化而改变，化合物被流动相洗脱带出色谱柱到达检测器的保留时间，与化合物从进样开始，到流出色谱柱的这一段时间内平均的K’的大小，以及色谱柱长，流动相的流速等有关，而化合物是否能产生窄的色谱峰，则取决于物质在将要脱离色谱柱的时候，K’能否比较小（即与固定相的作用力足够小，能被快速冲洗出去）。

打一个比方：

一辆汽车和一辆摩托车，通过一个长度为Lkm的隧道，汽车初始速度为20Km/h，摩托车的初始速度为35km/h,汽车的加速度为1.5m/s²，摩托车的加速度为0.8m/s²，那么谁将先通过隧道，汽车能否实现超车？

其实如果隧道足够短，由于初始由于摩托车速度快，虽然加速度小，但是汽车整体的移动速度仍然小于摩托车，汽车的平均速度就小于摩托车的速度，在这个整体水平上，汽车就会比摩托车慢到达，例如：当L=100m时，汽车通过的时间为8.42S，摩托车通过的时间为7.78S。

相反，如果隧道足够长，那么汽车在这段距离上的平均车速就比摩托车快，那么汽车就能实现弯道超车，例如当L=1000m时，通过隧道的时间，摩托车为39.3S；而汽车为33S。

这个比方里面的长为L的隧道（不同的隧道长度反映了车子通过隧道的加速时间的长短，导致最终通过隧道的平均速度不一样），这个就相当于色谱柱长，初始速度就相当于初始流动相比例下的化合物的K’，加速度就相当于lgK’与ψ线性曲线的曲线斜率，我们通常说色谱柱柱子长度是一定的，流动相在梯度变化的过程中，在这个时间段内，那么相同的柱子长度，K’变化的速率不同（就如同车子的加速度一样），在整个色谱行为上的平均值K’（如同车子在通过隧道的平均速度V’），就不一样，如果在梯度变化的时间范围内，通过相同的色谱柱，K’的平均值越小，就越容易先被洗脱出色谱柱，因此我们不能光关注化合物的初始K’，还需要关注化合物的K’的变化速率，这就很好的解释了，为什么有的物质在同一根色谱柱上，在A梯度时，化合物X比化合物G先出峰，而在另外一个梯度时，却是G先出峰（形势发生了逆转）。最终谁先出峰，与这些因素有关，另外当接近隧道出口时，若汽车速度加到越快（相对于化合物的K’越小），那么汽车或者摩托车整体通过隧道的时间就越短（t=车身长度/车速），对应于此时化合物出峰的色谱峰宽度就越窄。

例如，车身长为2.5m，如果最终通过隧道时车速为23m/s,则汽车完全通过隧道的时间为：0.10S，如果这时候车速为15m/s，则汽车完全通过隧道的时间为：0.16S，我们看到，出隧道时，车速越快，车子通过隧道的时间越短，反映在色谱上，就是峰的宽窄了。色谱峰流出的峰宽度反映在色谱图上的宽度即t₁-t₀。

总结

1、对于容量因子K’范围很大的化合物组，分离可以优先考虑梯度洗脱。

2、多组分的分离策略，考虑合适的分析时间内，得到窄峰和好的分离度

3、梯度洗脱是利用变化的有机相比例，即强度不同，达到改变化合物在两相中的作用力大小。

4、lg K’与ψ近似线性关系

5、K’随ψ的变化趋势的不同，使得梯度洗脱将不同化合物在色谱上的保留时间差异拉大，甚至出现超车。

6、K’≈0时，化合物几乎与固定相无作用力，能快速通过色谱柱，产生尖峰。