DNA核酸浓度的测定实验应用方案（超微量紫外分光法）

DNA核酸浓度的测定实验应用方案（超微量紫外分光法）

引言

寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA可以定量溶于缓冲液，构成核酸的嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，使核苷核和核酸在紫外线光具有特征性的吸收光谱，最大吸收峰为260nm。窄光带紫外分光光度计，长260nm．，比色杯光径1cm，1个吸光度值（1A）相当于50ug/ml双螺DNA，40ug/ml单螺旋DNA或RNA），20 ug/ml寡核苷酸。

测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，尔后测试空白液和样品液。然而，实验并非一帆风顺。读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。

原理

紫外分光光度法基于DNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，DNA/RNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在28Onm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。因此，可以用260nm波长进行分光测定核酸浓度，OD值为1相当于大约50ug/ml双链 DNA，单链DNA浓度约为33ug l ml，RNA约为40ug/ml，寡核苷酸约为35ug/ml。如用1cm光径，用 H,O稀释DNA/RNA样品n倍并以H,O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度:

DNA (mg/ml ) =50×OD260 读数×稀释倍数/1000RNA (mg/ml) =40×OD260读数×稀释倍数/1000。

A280nm是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估:纯DNA的A260/A280比值为1.8，纯RNA为2.0。假如比值低，表示受到蛋白（芳香族)或分类物质的污染，需要纯化样品。比值=1.5相当于50%蛋白质/DNA溶液。A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估:纯DNA和RNA的A260/A230比值为2.5。若比值小于2.0标明样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂污染，需要纯化样品。

A320nm或A340nm为检测溶液样品的浊度，该值应该接近0.0。假如不足，标明溶液中有悬浮物，需要纯化样品。

仪器及试剂

UL-1000超微量紫外可见分光光度计

比色杯

样本DNA

双蒸水